固形標本からの原発性卵巣癌細胞の採取:卵巣腫瘍標本から上皮性卵巣癌細胞を培養する方法

要約

出典:Pribyl, L. J. et al. 固体検体から原発性卵巣がん細胞を得るための方法。 (2014年)

このビデオでは、固形卵巣腫瘍組織標本から原発性卵巣がん細胞を分離し、特徴づける方法について説明します。このプロトコルを使用して得られた上皮がん細胞は、卵巣がんの開始と発症につながる可能性のあるプロセスを理解するのに適しています。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 組織処理

1. 無菌条件下で作業し、10 mlの新鮮で氷冷したPBSが入ったペトリ皿(60 mm x 60 mm)にサンプルを移し、滅菌カミソリの刃を使用して、さらに可能な限り小さい部分(2 mm以下)に切断します(図1Aおよび1B)。
2. ミンチ組織を、DMEM中の10 mLの予熱(37°Cで30分間)ディスパーゼII(2.4 U/mL)を入れた15 mLのコニカルチューブに移し、5% CO₂および37°Cで30分間インキュベートします。検体の最適な分解を確実にするために、5分ごとに細胞スラリーを手動で攪拌します。
3. 30分間のインキュベーション後、細胞スラリーを(10 mLの血清ピペットを使用して)50 mLの円錐管の上に置いた細胞ストレーナー(70 μmメッシュ)に移し、シリンジプランジャーを使用してメッシュに穏やかな圧力をかけます。未解離組織(メッシュの上部に残っている組織)を廃棄し、得られた細胞懸濁液を50mlの滅菌コニカルチューブに集めます。320 x gで4°Cで7分間遠心分離します(図2)。
4. 上清を捨て、細胞ペレットを10%FBSを含むDMEM10 mLに再懸濁します。
5. 細胞懸濁液をペトリ皿内で5%CO₂および37°Cでインキュベートします(図3)。
6. 最初のメッキから24時間後に培地を交換してください。これにより、細胞の破片と培養物に存在する赤血球の大部分を除去できます。
7. 次の2週間は3日ごとに培地を交換し、その後、一次EOCの培養物を下流のアプリケーションの準備が整います。

結果

図 1.臨床検体の処理。A) 固体試料を、10 mLの新鮮で氷冷した1x PBSを含むシャーレに移しました。B) 臨床検体をさらに約2mmの大きさに切断したもの

図 2.未解離組織からのEOC細胞の分離。酵素消化後、臨床検体を細胞ストレーナーに移し、シリンジプランジャーを使用して消化された臨床検体に穏やかな圧力を加えます。これにより、結合組織からのEOCの機械的剥離とEOC細胞の回収が可能になります

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBS、滅菌済み	インビトゲン	14190-144
スクリュー蓋、ポリプロピレン製試料 瓶用, 滅菌	サーモサイエンティフィック
DMEM媒体、滅菌	インビトゲン	11995年065月
ウシ胎児血清、滅菌済み	Thermo Scientific ハイクロン	03 SH30396
100x ペニシリン-ストレプトマイシン、液体	インビトゲン	15140-122
ディスパーゼII、滅菌済み	ロシュ	04942 078 001
小さな細い先端の鉗子とメス ブレード, 滅菌	フィッシャーサイエンティフィック	鉗子:08-953E、ブレード: 08-927-5D
小型解剖ハサミ、滅菌	フィッシャーサイエンティフィック	08-945
15 mlコニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み	BDファルコン	352097
50 mlコニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み	BDファルコン	352027
10 ml 血清ピペット、滅菌済み	コーニング	13-678-11E
6 mlシリンジプランジャー、滅菌済み	タイコヘルスケア	8881516911
ナイロンフィルター(70μm)セルストレーナー、 不妊	BDファルコン	352350
5cmシャーレ、滅菌済み	コーニング	430166
10cmシャーレ、滅菌済み	コーニング	430167