固形標本からの原発性卵巣癌細胞の採取:卵巣腫瘍標本から上皮性卵巣癌細胞を培養する方法

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 組織処理

1. 無菌条件下で作業し、10 mlの新鮮で氷冷したPBSが入ったペトリ皿(60 mm x 60 mm)にサンプルを移し、滅菌カミソリの刃を使用して、さらに可能な限り小さい部分(2 mm以下)に切断します(図1Aおよび1B)。
2. ミンチ組織を、DMEM中の10 mLの予熱(37°Cで30分間)ディスパーゼII(2.4 U/mL)を入れた15 mLのコニカルチューブに移し、5% CO₂および37°Cで30分間インキュベートします。検体の最適な分解を確実にするために、5分ごとに細胞スラリーを手動で攪拌します。
3. 30分間のインキュベーション後、細胞スラリーを(10 mLの血清ピペットを使用して)50 mLの円錐管の上に置いた細胞ストレーナー(70 μmメッシュ)に移し、シリンジプランジャーを使用してメッシュに穏やかな圧力をかけます。未解離組織(メッシュの上部に残っている組織)を廃棄し、得られた細胞懸濁液を50mlの滅菌コニカルチューブに集めます。320 x gで4°Cで7分間遠心分離します(図2)。
4. 上清を捨て、細胞ペレットを10%FBSを含むDMEM10 mLに再懸濁します。
5. 細胞懸濁液をペトリ皿内で5%CO₂および37°Cでインキュベートします(図3)。
6. 最初のメッキから24時間後に培地を交換してください。これにより、細胞の破片と培養物に存在する赤血球の大部分を除去できます。
7. 次の2週間は3日ごとに培地を交換し、その後、一次EOCの培養物を下流のアプリケーションの準備が整います。

図 1.臨床検体の処理。A) 固体試料を、10 mLの新鮮で氷冷した1x PBSを含むシャーレに移しました。B) 臨床検体をさらに約2mmの大きさに切断したもの

図 2.未解離組織からのEOC細胞の分離。酵素消化後、臨床検体を細胞ストレーナーに移し、シリンジプランジャーを使用して消化された臨床検体に穏やかな圧力を加えます。これにより、結合組織からのEOCの機械的剥離とEOC細胞の回収が可能になります

図 3.得られたEOC細胞懸濁液のプレーティング。未解離組織を除去した後、細胞懸濁液を遠心分離し、10% FBSを含む10 mLのDMEMに再懸濁し、5% CO2および37°Cのシャーレでインキュベー