中皮クリアランスアッセイ:卵巣がんスフェロイドの中皮細胞単層への浸潤能力を定量化するIn Vitro技術

要約

出典:Davidowitz, R. A. et al.in vitro中皮クリアランスアッセイ。J. Vis. Exp.(2012年)

このビデオでは、蛍光標識細胞とタイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、卵巣がんスフェロイドと中皮細胞との相互作用を定量的に測定する技術について説明しています。このin vitroアッセイは、転移した卵巣がん細胞スフェロイドと腹腔内を覆う中皮細胞との間の相互作用をin vivoでモデル化します。

プロトコル

1. 卵巣がん細胞スフェロイド形成

1. RFP発現卵巣がん細胞を10% Base Medium(199とMCDB105の50:50の混合物、10%の不活化ウシ胎児血清、および1%ペン連鎖球菌を含むカスタム細胞培養培地)で培養します。非標識卵巣がん細胞でRFPを発現させるには、RFPを含むプラスミドを細胞にトランスフェクションし、RFPを発現する細胞を選択します。あるいは、ウイルスベクターを使用して蛍光タンパク質を一過性に発現させたり、細胞を赤色蛍光セルトラッカー色素(Invitrogen)で事前にインキュベートしたりすることもできます。
2. 卵巣がんスフェロイドを形成する前に、低接着性の96ウェル丸底培養皿を調製する必要があります。低接着性の培養プレートを作製するには、96ウェル細胞培養皿の各ウェルに30 μLのポリ-HEMA溶液(1 mLの95% EtOHに6mgのポリヒドロキシエチルメタクリレート)を加えます。96ウェルプレートを37°Cの非加湿インキュベーターでインキュベートしてエタノールを蒸発させ、各ウェルにポリHEMAの膜を残します。このポリHEMAフィルムは、細胞がウェルの底に付着するのを防ぎ、細胞を懸濁状態で増殖させます。[また、超低接着性カルチャープレート(Corning)を使用することもできます。
3. 次に、卵巣がん細胞をトリプシン化し、卓上遠心分離機(ヘレウス社)で900 RCFの細胞を3分間ペレット化します。上清を吸引し、10%ベースメディウムに再懸濁します。.
4. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
5. 10%ベース培地50μLあたり100個の細胞が存在するように細胞の濃度を調整します。
6. 均一に懸濁した希釈細胞懸濁液50 μLを96ウェルポリHEMAコーティング培養皿の各ウェルに加えます。
7. 96ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターで16時間インキュベートし(この時間は、特定の細胞株が多細胞スフェロイドを形成するのにかかる時間または所望の実験条件に応じて増減する必要があります)、卵巣がん細胞が一緒に集まり、各ウェルで単一の多細胞スフェロイドを形成します。一部の腫瘍細胞はこの期間中にアポトーシスを起こす可能性があるため、アポトーシスが誘導される前の時間を選択することが不可欠です。

>2. 中皮細胞単層形成

1. 細胞培養フードで、5 μgのフィブロネクチン/mL PBS溶液を2 mLのディッシュの各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートすることにより、6ウェルガラス底MatTekディッシュのウェルをフィブロネクチンで事前にコーティングします。MatTekディッシュのガラス底の光学的品質により、高解像度の顕微鏡イメージングが可能になります。
2. GFP発現中皮細胞を10% Base Mediumで培養します。中皮細胞のプレートをトリプシン処理し、卓上遠心分離機(Heraeus)で900 RPMで3分間スピンダウンし、上清を吸引し、10%塩基培地に再懸濁します。ここで使用した中皮細胞は、取得時にすでにGFPを発現していましたが、GFP cDNAを含むプラスミドをトランスフェクションするか、緑色蛍光セルトラッカー色素(Invitrogen)で細胞を事前にインキュベートすることにより、非標識中皮細胞を作製できます。
3. 30分間のフィブロネクチンインキュベーション(ステップ2.1)後、MatTekディッシュのウェルを2mLのPBSで洗浄します。
4. PBSを吸引し、6ウェルMatTek皿の各ウェルでウェルあたり6 x10⁵中皮細胞をプレート化します。MatTekディッシュを37°Cの細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートし、中皮細胞がディッシュに付着して単層を形成するようにします。

3. 中皮細胞クリアランスアッセイ

1. ピペットを使用して、96ウェルポリHEMAコーティングプレートから卵巣がんスフェロイドを採取します。
2. 中皮細胞単層を含む6ウェルMatTek皿の1つのウェルから培地を吸引します。2mLのPBSで一度洗浄します。96ウェルプレートのすべてのスフェロイドをMatTekディッシュの1つのウェルに追加します(イメージングできない部分に着地するスフェロイドを考慮して、イメージングされるスフェロイドの数の~3倍
)。
3. MatTekディッシュを、少なくとも8時間のタイムラプスイメージングを実行できる倒立広視野蛍光顕微鏡のステージに置きます。電動ステージを使用して、1回の実験で複数のスフェロイドインターカレーションイベントを含むディッシュ内の複数の位置をイメージングします。パーフェクトフォーカスシステムを内蔵し、低[20x-0.75NA]倍率/ NA微分干渉コントラスト(DIC)光学系を備えたニコンTi-E倒立電動広視野蛍光タイムラプス顕微鏡、0.52 NAの長作動距離(LWD)コンデンサーを備えたニコンハロゲントランスイルミネーター、ニコンの高速(<100ミリ秒のスイッチング時間)励起および発光フィルター(GFP Ex 480/40、Em 525/50、 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50)、サッター高速透過および落射蛍光光路スマートシャッター、ニコンのリニアエンコード電動ステージ、浜松製作所のORCA-AG冷却電荷結合素子(CCD)カメラ、温度と_CO2制御を備えた特注の顕微鏡インキュベーションチャンバー、Nikon NIS-Elements ARソフトウェアバージョン3、TMC除振テーブル。
4. 卵巣がん細胞のスフェロイドは皿の底に沈殿し、中皮細胞単層に付着します。20+スフェロイド/単分子膜相互作用のGFP、RFP、および位相画像を10分ごとに8時間収集します。
5. RFP発現卵巣がん細胞スフェロイドは、GFP発現中皮細胞単層に侵入し、単層に穴を生じます。8時間後、Elementsソフトウェア(または画像Jなどの別の適切なソフトウェア)を使用してGFP画像のブラックホールを追跡し、穴のサイズを測定します。8 時間後の穴のサイズを、時間 0 の対応する RFP イメージの回転楕円体のサイズで割ることにより、穴のサイズを初期回転楕円体のサイズに正規化します。この例では、穴のサイズは一度だけ測定されましたが、8時間の実験を通じて複数回測定することで、インターカレーションのダイナミクスをよりよく理解することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
OVCA433卵巣がん細胞			デニス・スラモン博士からの贈り物
ZT中皮細胞			Dr. Tan Inceからの贈り物
ミディアム 199	ライフテクノロジーズによるGIBCO	19950
MCDB105	Cell Applications株式会社	117から500
FBS熱不活性化	GIBCO、ライフテクノロジーズ	10082
ペン連鎖球菌	GIBCO、ライフテクノロジーズ	15070
96ウェルプレート	コーニング	3799
ポリヒドロキシエチルメタクリレート(ポリHEMA)192066-25G	シグマ・アルドリッチ		ポリHEMA溶液の場合、6mgのポリHEMA粉末を1mlの95%EtOHに溶解
EtOH	Pharmco-AAPERの	111ACS200	dH20で95%に希釈
細胞培養フード	ヌアイレ	NU-425-300
組織培養インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)	3110
ポリHEMAプレート用インキュベーター305	Labline機器	インペリアルIII
卓上遠心分離機	ヘレウス・インスツルメンツ	01 75003429日
6ウェルガラス底皿	MatTek株式会社	P06G-1.5-20-F
フィブロネクチン	シグマ・アルドリッチ	F1141-1MG
PBSの	セルグロ	21-040-履歴書
顕微鏡	ニコンインスツルメンツ		Ti-E パーフェクトフォーカスシステムを内蔵した倒立型電動蛍光タイムラプス顕微鏡
レンズ	ニコンインスツルメンツ		20X-0.75数値
ハロゲントランスイルミネーター	ニコンインスツルメンツ		0.52 NA 長作動距離コンデンサー
励起フィルターと蛍光フィルター	クロマテクノロジー株式会社		GFP Ex 480/40、EM 525/50 RFPmCherry Ex 575/50 EM 640/50
透過光路と落射蛍光光路	サッターインストゥルメント株式会社		スマートシャッター
リニアエンコード電動ステージ	ニコンインスツルメンツ
冷却された電荷結合デバイスカメラ	(株)浜松ホト	オルカAG
温度とCO2制御を備えた顕微鏡インキュベーションチャンバー			カスタムメイド
除振テーブル	TMCの
NIS-Elements ソフトウェア	ニコンインスツルメンツ		バージョン3

年 名 します の 名 シリーズ