がん細胞の最適な抑制性腫瘍治療フィールド周波数の決定:がん細胞の生存率に対するTTフィールドの影響を評価するための非侵襲的In Vitro法

要約

出典:Porat, Y. et al.腫瘍治療フィールド(TTフィールド)を使用して、がん細胞の最適な阻害頻度を決定します。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、TTFieldの適用がin vitroでの卵巣癌細胞株の成長に及ぼす影響を示しています。このアッセイは、がん細胞の数を最大限に減らすことができる電界の最適な周波数を決定するのに役立ちます。

プロトコル

1. TTフィールド In Vitroアプリケーションシステム - ベースプレートとディッシュのメンテナンス

1. 流水で皿と皿カバーをすすぎます。その後、脱イオン水ですすぎ、下向きにして風乾します。
2. 以前の実験で化学療法剤/薬剤が皿に追加されている場合は、各皿に5%の軽い洗剤溶液を入れ、一晩放置します。.
   1. 皿の中に洗剤の痕跡が入らないように、流水で皿をよくすすいでください。皿と皿カバーを脱イオン水ですすぎ、下向きに風乾します。
3. 清潔で乾燥した皿をカバー付きで滅菌バッグに入れます。袋を密封し、皿を下にしてオートクレーブに入れます。121°C以下で30分間オートクレーブします。
4. オートクレーブをドライプログラムにセットし、オートクレーブのドアを部分的に開き、皿を30分間乾燥させます。
5. ベースプレートは、70%エタノールで軽く湿らせた布で拭きます。

>2. 実験のセットアップ

>注:このプロトコルで使用されるすべての機器と材料は、材料リストに記載されています。以下のすべての手順は、無菌状態が維持されている間、層流キャビネット内で実行する必要があります。

1. セクション1で説明されているように、清潔で滅菌済みのTTFieldsディッシュとカバーを準備します。ベースプレートは、70%エタノールで軽く湿らせた布で拭きます。
2. TTフィールドディッシュをカバー付きのベースプレートに取り付けるには、ディッシュを軽く押し下げ、ディッシュの縁がベースプレートの3本のピンにロックされるまで時計回りに約5mm回転させます。滅菌済みの22 mmカバースリップ(処理されたプラスチックまたはガラス)を各皿の底に置きます。
3. 細胞懸濁液を完全な増殖培地(U-87 MGおよびF98用のDulbeccoの改変Eagleの培地;A2780およびOVCAR-3のRPMI。材料リストに記載されているように補足されています).
   注:細胞濃度は、細胞の種類と実験時間によって異なります。実験終了までに80%-90%のコンフルエント細胞増殖を超えてはならない
   注意:ヒト細胞株は生物学的な危険性を示す可能性があるため、適切な安全対策を講じて取り扱う必要があります。
4. 200 μLの細胞懸濁液(通常、200 μLに5,000〜20,000個の細胞を200 μLで72時間の実験で、倍加時間にもよります)を各カバースリップの中央に滴として置き、ディッシュの蓋で覆います。
5. 細胞が接着するまで、CO₂インキュベーターで37°Cでインキュベートします。この段階では、一晩のインキュベーションが可能です。
6. 200μLまたは1,000μLのピペットを使用して、液滴から液体を吸引します。
7. 2 mLの完全増殖培地を静かにピペットで動かして、各皿を満たします。滅菌チップを使用してピペットを動かし、カバーガラスの端をそっと軽くたたいて、スライドの下に時々引っかかる気泡を放出します。
8. ディッシュに蓋をして、TTフィールド処理が始まるまで37°Cの_CO2インキュベーターに入れます。

3. TTフィールドアプリケーション

1. TTFields皿が取り付けられたベースプレートを冷蔵_CO2インキュベーターに移します.
   注:in vitro TTフィールド塗布は熱を発生します。したがって、皿の温めを補うために冷蔵インキュベーターが必要です。TTフィールドの強度が高いほど、より多くの熱が発生し、インキュベーターの周囲温度が低くなります(表1を参照)。臨床的に関連性のあるTTフィールド強度は、TTフィールドアプリケーションのインキュベーター温度が18-30°Cの範囲にあるときに達成されます。
2. フラットケーブルのメスコネクタをベースプレートに接続します。TTフィールドジェネレーターをオンにします。
3. TTFields in vitroアプリケーションシステムソフトウェアを起動し、実験設定を選択します。
   1. 新しい実験を定義します。実験の名前と実験の所有者を、コンピューター画面のソフトウェア ユーザー インターフェイスに入力します。各皿またはベースプレートの周波数と目標温度を調整します。
4. ソフトウェアを使用してTTFieldsアプリケーションを起動します。
5. すべてのディッシュが正しく接続され、モニターに水色が表示されていることを確認します。皿が赤い枠で囲まれている(正しく接続されていない)場合は、接点が回復して皿が水色になるまで、皿をゆっくりと押し下げ、ゆっくりと前後に回転させます。
6. TTFields in vitroアプリケーションシステムは、最大24時間稼働させます。
7. 実験がエンドポイントに達した場合は、ソフトウェアの [END EXPERIMENT] ボタンをクリックして実験を停止し、手順 5 に進みます。そうでない場合は、[PAUSE experiment] をクリックします。
8. フラットケーブルコネクタをベースプレートから外します。インキュベーターから皿が入ったベースプレートを層流キャビネットに移します。
9. 24時間ごとにすべての皿の培地を交換し、ベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。フラットケーブルを使用してベースプレートを発電機に接続します。[続行] ボタンをクリックして実験を続行します。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名

インキュベーター周囲温度	予想TTフィールド強度
(°C)	(V/cm RMS)
18	1.62
19	1.55
20	1.48
21	1.41
22	1.33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0.97
28	0.9
29	0.83
30	0.76

>表 1.インキュベーターの周囲温度とTTフィールドディッシュ内の予想TTフィールド強度。

>4. コントロールサンプル

>注:TTフィールド処理細胞と同様の条件で制御細胞を増殖させます。ただし、TTフィールドの適用は除きます。

1. TTフィールド処理されたサンプルのめっきに使用されるのと同じ懸濁液および同様の表面上のプレートコントロールサンプル。
2. コントロールディッシュを37°Cの_CO2インキュベーターに入れます。
3. TTフィールド処理されたディッシュのメディウム条件に合わせて、24時間ごとにディッシュのメディウムを交換してください。

>5. 実験終了

1. [END EXPERIMENT] をクリックした後、ソフトウェアがシステムからすべてのレコードを取得し、レコードをコンピューターに保存するのを待ちます。
2. REPORTSボタンを使用して再view 各ベースプレートの温度、電流、および抵抗ログファイルは、すべての皿が実験計画に従って処理されたことを確認します。
   注:すべてのレポートとログは、実験終了後にコンピュータに保存され、いつでも確認することができます。
3. TTフィールドジェネレーターのスイッチを切ります。
4. フラットケーブルをベースプレートから外し、インキュベーターから取り外します。
5. セラミック皿を取り外すには、皿を押し下げて反時計回りに回し、ベースプレートからロックを解除します。
6. 皿を層流キャビネットに持ち込み、カバースリップを無菌的に取り外します。それらを新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む滅菌ペトリ皿に移し、さらなる検査と評価を行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Invitroシステムおよびソフトウェア	ノボキュア	ITG1000とIBP1000	各ユニットには、TTフィールドジェネレーター1台、ベースプレート1枚、カバー付きTTフィールドディッシュ8枚、フラットケーブル1台が含まれています。
滅菌バッグ	ウェストフィールドメディカ	24882
プラスチックカバースライド	サーモサイエンティフィック(NUNC)	174977	前処理および滅菌済み
ガラスカバースライド	Thermo Scientific(Menzel-Gläser)	CB00220RA1	必要に応じて滅菌します
ダルベッコの改造イーグルの媒体	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	01-055-1A	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
RPMIの1640	ギブコ	21875-034	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
ウシ胎児血清(FBS)	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	04-007-1A	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
L-グルタミン 200 mM (100x)	ギブコ	〒25030-029
ペン/溶連菌(10,000 U/mLペニシリン、10,000 μg/mLストレプトマイシン)	ギブコ	15140-122
ピルビン酸ナトリウム溶液100mM	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	03-042-1B
ヘペスバッファー1 M	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	03-025-1B
ウシ膵臓由来のインスリン溶液	シグマ・アルドリッチ	10516-5ミリリットル
0.25%トリプシン/ EDTA	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	03-050-1B	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
メタノール	メルク	1.06009.2511	使用前に冷凍庫で-20°Cに冷却してください
PBSの	バイオロジカル・インダストリーズ(イスラエル)	02-023-1A	カルシウムとマグネシウムなし
A2780	ECACC	93112519	FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100 U/mL / 100 μg/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)、Hepesバッファー(12 mM)を添加したRPMI 1640で増殖します。
F98	ATCCの	CRL-2397	FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100 U / mL / 100 μg / mL)、ピルビン酸ナトリウム を添加したダルベッコの改変イーグル培地で成長します (1 mM)およびグルタミン(2 mM)。
OVCAR-3	ATCCの	HTB-161	FBS(20%)、ペン/連鎖球菌(100 U/mL / 100 μg/mL)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)、Hepesバッファー(12 mM)、インスリン(10 μg/mL)を添加したRPMI 1640で増殖します。
U-87 MG	ATCCの	HTB-14	FBS(10%)、ペン/連鎖球菌(100 U / mL / 100 μg / mL)、ピルビン酸ナトリウム(1 mM)およびグルタミン(2 mM)を添加したダルベッコの改変イーグル培地で増殖します。
冷蔵CO2インキュベーター	キャロン	7404-10-3
層流キャビネット	ADSラミネア	Bio12 および VSM12