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鶏卵の胚を含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. 卵の準備
- 卵を受け取る前に、製造元の指示に従って、卵インキュベーターを37.8°C(100°F)に組み立てて平衡化し、湿度60〜70%にします。
手記：汚染リスクを最小限に抑えるために、オートクレーブ水を使用して湿度を制御することができます。
- 認定された実験室グレードの卵供給業者から受精したロードアイランドレッドチキンの卵を受け取ったら、ペーパータオルで殻の表面を乾拭きます。軽く湿らせたペーパータオルを使用して、付着した材料を取り除くことができます。すぐに乾かしてください.
手記：43.3°C未満の液体で殻を濡らすと、卵にバクテリアが混入する可能性があります。卵を洗うか消毒することを選択した場合、液体の温度は43.3〜48.9°Cでなければなりません。消毒剤の選択は、懸念の原因となっている微生物に基づいて行う必要があります。
- 鉛筆またはマーカーを使用して、卵に日付をラベル付けします。これは開発日 0 と見なされます。
- 卵を卵インキュベーターに入れ、CAMの発達を可能にするために回転させて少なくとも7日間インキュベートします。自動回転子を使用することも、卵を1日あたり2〜3回180°回転させることもできます。
2. 卵を開ける
>注:CAMが完全に発達したときに卵を開く必要があります。これは通常、開発 7 日目または 8 日目です。
- バイオセーフティキャビネットを70%エタノールで消毒します。同様に、エッグラック、エッグキャンドラー、マーカー、炭化ケイ素砥石と円形カッティングホイールを備えたコードレス回転工具、18G針、1/4インチ真空チューブ付きピペットコントローラー、梱包テープ、オフィス用ハサミ、湾曲したハサミ、セムケン(または類似の)鉗子、綿球、および6 x 7cmの透明フィルムドレッシングを消毒してバイオセーフティキャビネットに入れます。可能な限り、滅菌済み、使い捨て、またはオートクレーブ滅菌済みのツールを使用してください。
- 卵の回転子の電源を切ります。卵ラックのバイオセーフティキャビネットに約1〜3個の卵を入れます。暗闇の中で、エッグキャンドラーを卵の殻に当てて、エアセルを特定します。エアセルの位置をマークします.
手記：エッグキャンドラーからの照明の強度は、卵の内部を視覚化するために重要です。気細胞または血管系が一貫して見えにくい場合は、エッグキャンドラーの電池を交換してみてください。
- エッグキャンドラーを殻の上に動かして、大きな血管網を見つけます。必要に応じて卵を回転させます。理想的な血管系は、卵の中央近くで枝分かれすることです。マーカーを使用して、移植に使用する血管系を描きます。
- ボンネットのライトを点灯します。炭化ケイ素砥石を取り付けたコードレス回転工具を使用して、エアセルの中心の真上にシェルに小さな穴を開けます。シェルの大部分が取り除かれるまでドリルで穴を開けますが、白い内膜は無傷です.
手記： 血管系を標的とする前にエアセルに穴を開けることで、CAMと血管系ではなく、エアセル上の特定の卵殻の厚さを決定できます。CAMまたは血管系が破壊されると、卵子は着床に使用できなくなります。
- エアセルの場合と同様に、血管窓が開く別の小さな穴を開けて開きます(ステップ2.4)。
- 18Gの針を使用して、白い内膜をエアセルと血管系にそっと突き刺します。シェルを貫通できない場合は、もう少し慎重にドリルで穴を開けます。白い内膜(CAMではない)が、ドリル領域全体で破壊されていることを確認してください。メンブレン片の除去は不要です
手記：このステップでCAMまたは血管系が乱れた場合は、卵子を捨ててください。ドリルで開けた穴から血液やアルブミンが漏れていると、損傷は明らかです。
- フードライトを消します。エッグキャンドラーを使用して、エアセルが卵の端から血管系の上の領域に移されたことを確認します。必要に応じて、ピペットコントローラーに挿入された真空チューブを元のエアセルの上の穴の周りに置き、短くバーストして吸引を静かに加えてエアセルを動かします。
- マーカーを使用して、air-CAM境界の約0.5cm内側にエアセルの新しい位置の輪郭を描きます。新しいエアセルのすぐ上に梱包テープを貼り付けます。必要に応じて、標準のオフィスハサミを使用してテープを適切なサイズにトリミングします。
手記：テープはシェル内の空気の流れを乱す可能性があるため、エアセルを完全に覆うために必要以上に大きくしないでください。
- 卵をインキュベーターに戻して、新しいエアセルを上に向けて回転せずに温めます。残りの卵を開くために手順2.2〜2.9を繰り返します.
手記：プロトコルはここで一時停止できます。CAM開発の品質が不明な場合は、少数の卵をステップ2.16に進ませてから、残りの卵を開ける必要があります。
- 移動したエアセルを持つ約1〜3個の卵をバイオセーフティキャビネットのエッグラックに置きます
手記：開いた卵に汚染が入り込まないように注意する必要があります。したがって、常にバイオセーフティキャビネット内の卵を開け、可能な限り滅菌された道具と機器を使用してください。
- 円形のカッティングホイールを取り付けたコードレス回転工具を使用して、手順2.8で描いたエアセル境界に小さな線を切ります。これが実際のair-CAM境界の約0.5cm内側にあることを確認し、CAMまたは血管系を乱さないようにします。シェルを完全に切り取りますが、CAMや血管系を乱すほど深く貫通しないように注意してください。
- 湾曲したハサミを使用して、残りのエアセルの周りを切り取り、シェルに窓を作成します。
手記： 除去された殻に血液または膜が存在する場合、卵子は着床に適していません。卵の大部分がきれいに開かない場合は、CAMの形成を改善するために、残りの卵を開くために少なくとも1日余分に待つことを検討してください。残りの卵の殻に穴が開いていない場合は、インキュベーター内の卵の回転を再開する必要があります。
- 胚の生存率を確認します。生存可能な胚は、広範な血管系、透明なアルブミン、胚の動き、または目に見える心拍を示します。
- Semken鉗子を使用して、滅菌綿球から綿の小片を引き出します。CAM表面をそっと拭き取り、シェルのほこりや破片を取り除きます。
手記：破片の除去は、卵が開かれたのと同じ日に行わなければなりません。
- シェルの開口部を6 x 7 cmの透明フィルムドレッシングの4分の1ピースで覆います。
- 卵をインキュベーターに戻します。開いた窓を上にして卵がしっかりと座り、CAMが透明なフィルムドレッシングに触れないようにします。エッグラック、エッグローテーターの端、または別の適切なアイテムを使用して、転がり続ける卵を支えます。
- 残りの卵をすべて開くために手順2.10-2.16を繰り返します.
手記： 卵子の開封は、着床と同じ日に完了する必要はありません。少なくとも1日待つと、殻を開けて生存能力が損なわれた卵を排除するのに役立ちます。