ニワトリ絨毛尿膜ベースのがんモデリング:がん細胞の腫瘍形成と転移を研究するためのIn Ovoモデル

要約

出典:Sharrow, A. C. et al.ニワトリ絨毛尿膜をIn vivoモデルを使用して婦人科および泌尿器科がんを研究しています。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、ニワトリの絨毛尿膜にがん細胞を移植してin ovoモデルを生成する方法について説明します。このモデルは、卵巣がん細胞をうまく生着させて、婦人科がんの進行を研究します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 移植のための癌細胞懸濁液の準備(オプション1)

>注:これは移植の直前に完了する必要があり、理想的には7日目から10日目の間に行われるべきです。移植日の詳細については、ステップ3または4の冒頭にある注意事項をご覧ください。このアプローチは、すべての細胞株および培養腎臓がん腫瘍消化物に使用されました。

1. 細胞外マトリックス溶液を氷上で解凍します。
2. 機械的消化および/または酵素的消化を使用して、移植される細胞タイプに適した方法を使用して単一細胞懸濁液を取得します。
3. 移植に適した培地に移植する細胞の総数を再懸濁します。卵子あたり1-2 x 10⁶細胞のインプラントが一般的です.
   手記：細胞株の移植に使用される培地は、通常、FBSまたは血清補充を含む、細胞の培養に使用される完全な培地です。腫瘍消化物の移植には、通常、同じ種類のがん細胞株の培養に使用される完全な培地が使用されます。ただし、実験的に必要な場合は、培地の製剤の調整を行うことができます。腫瘍の発生と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。
4. 使用する細胞に適した遠心分離速度と時間を使用して細胞をペレット化します。一般的な速度は250〜300 x gで、時間は5〜10分です。
5. ピペッティングにより、ペレット化した細胞から上清を除去します。細胞を残留培地に機械的に再懸濁します。これは、フリックまたはピペッティングにより行います。氷の上に置いて冷まします。適切なサイズのピペットを使用して、細胞と培地の容量を測定します。
6. 1-2 x 10⁶細胞が卵子あたり20-100μLの容量に移植され、最終的な細胞外マトリックス濃度が2.7-4 mg / mLタンパク質になるように、移植量を計算します。この計算に従って、培地、任意の所望の成長因子または添加剤、および細胞外マトリックス溶液を添加します。移植の準備ができるまで氷の上に置いてください.
   手記：ステップ1.3および1.6の計算では、グループ内のすべての卵子に十分な量を確保するために、少なくとも半分の卵子インプラントの追加容量を組み込む必要があります。卵巣癌細胞株(すなわち、SKOV3およびID8)の移植のために、卵子あたり10個の⁶細胞を移植した。腎細胞癌細胞株RENCAの移植には、消化された初代ヒト腎細胞癌由来の培養細胞、前立腺癌細胞株(すなわち、CWR、C4−2、およびMyC−CaP)、および膀胱癌細胞株(すなわち、HT−1376およびT24)を移植するために、2×10⁶細胞を移植した。

2. 移植のための腫瘍片の準備 (オプション 2)

>注:これは移植の直前に完了する必要があり、理想的には7日目から10日目の間に行われるべきです。移植日の詳細については、ステップ3または4の冒頭にある注意事項をご覧ください。原発性卵巣がんと膀胱がんは腫瘍片として移植されました。

1. 細胞外マトリックス溶液を氷上で解凍します。任意の成長因子または添加剤を含む適切な培地で、最終タンパク質濃度2.7〜4 mg / mLに希釈します。氷上を保つ.
   手記：腫瘍片の移植には、通常、同じ種類のがん細胞株の培養に使用される完全な培地が使用されます。ただし、必要に応じて培地製剤の調整を実験的に行うことができます。.腫瘍の生着と成長への影響は、経験的に決定する必要があります。
2. メスやハサミを使用して、新鮮な腫瘍からピースを切除します。理想的なサイズは、両側で2〜5mmの範囲です。移植の準備ができるまで、組織を培地に浸しておきます。

3. 焦げ付き防止リングを使用した埋め込み(オプション1)

>注:CAMが完全に開発されている場合、細胞は開発7日目から移植される可能性があります。着床は、腫瘍の発生と目的の実験に十分な時間を確保する孵化前であればいつでも行うことができますが、受精後10日目頃に胚の免疫細胞が存在し始めることに注意してください。腫瘍の増殖速度は細胞の種類によって大きく異なり、目的の細胞の種類について経験的に決定する必要があります。卵巣がんと前立腺がん細胞は、ノンスティックリング法を使用して移植されました。焦げ付き防止リングが利用できない場合は、ピペットチップを同様のサイズにカットして使用できます。

1. 70%エタノールを使用して、バイオセーフティキャビネットと必要なすべてのツールを消毒します:エッグラック、湾曲した虹彩鉗子、焦げ付き防止リング(内径1/4インチ)、ガラス攪拌棒、適切な容量のピペットとチップ、6 x 7 cm透明フィルムドレッシング、オフィスはさみ、マーカーまたは鉛筆。可能な限り、滅菌済み、使い捨て、またはオートクレーブ滅菌済みのツールを使用する必要があります。
2. 着床する卵をバイオセーフティキャビネットのエッグラックに置きます。管理可能な卵の数を選択します。最大 6 つが一般的です。卵を扱っている間、卵が大幅に冷えるのを避けてください。
3. シェルの破片を引き離さないように、開いた窓に向かって端を転がして、シェルから透明なフィルムドレッシングを取り除きます。卵子が生存可能で健康であることを確認してください。理想的な卵は、開いたエリアの中央に大きな容器があり、そこから小さな容器が分岐しています。
4. 湾曲した虹彩鉗子を使用して、滅菌された焦げ付き防止リングをCAMの血管上、理想的には分岐点の上に置きます。滅菌ガラス攪拌棒を使用して、CAMを優しく摩耗させます。
5. ステップ1.6の細胞懸濁液を焦げ付き防止リングの中央にピペットで移します。あるいは、鉗子を使用してステップ2.2の腫瘍片を焦げ付き防止リングの中央に配置し、ステップ2.1で生成された細胞外マトリックス溶液の20〜50μLで覆います。
6. 開口部を6 x 7 cmの透明フィルムドレッシングの4分の1ピースで密封します。卵子に適切なインプラントの名称をラベル付けします。
   手記：グループ内の卵に番号を付けると、縦断的な観察が容易になります。
7. 卵をインキュベーターに戻します。殻の開口部が直立し、卵がしっかり固定されていることを確認してください。
   手記：卵は回転せずに卵インキュベーターに戻すことができます。あるいは、CO₂を不活性化した37-38°Cの細胞インキュベーターと湿度を監視するための湿度計(50%-80%)を使用して、高い移植後生存率を得ることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
010 テフロン (フッ素樹脂) ホワイト 55 デュロショアD Oリング	Oリングストア	TEF010	1/4"ID X 3/8" OD X 1/16"CS ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)。
繊細な操作はさみ。闉;シャープシャープ;刃の長さ30mm。4-3 / 4インチ全長	ロボズサージカル	RS6703	これは例として提供されています。同様の湾曲したハサミでも機能します。
ドレメル8050-N / 18マイクロ8V最大ツールキット	ドレメル	8050-N/18	このキットには、必要なすべてのツールが含まれています
受精鶏卵(ロードアイランドレッド-ブラウン、ラボグレード)	AAラボエッグス株式会社	該当なし	このサプライヤーは地域ごとにのみ配送するため、地元の卵サプライヤーを特定する必要があります。
Hovabator Genesis 1588デラックスエッグインキュベーターコンボキット	インキュベーター倉庫	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	他の卵インキュベーターを使用することもできますが、その信頼性を確認する必要があります。移植後、CO2を無効にした細胞インキュベーターも使用できます。
インキュブライトクールライトエッグキャンドラー	インキュベーター倉庫	1102	他のキャンドラーを使用することもできますが、私たちがテストしたキャンドラーの中ではこれが好まれます。このキャンドラーは、前述のインキュベーターキットに含まれています。
マトリゲル膜マトリックスHC;LDEVフリー	コーニング	354248	細胞外マトリックス溶液
SKOV3	ATCCの	HTB-77	ヒト卵巣癌細胞株。
ゴム製ポリスマン付き攪拌ロッド、直径5mm、長さ6インチ	ユナイテッド・サイエンティフィック・サプライズ	GRPL06	これは例として提供されています。同様のガラス攪拌棒も同様に機能します。
試料用鉗子	電子顕微鏡科学	72914	これは例として提供されています。生物発光イメージングのためにシェルを引き離すために使用される鉗子は、長さ約12.8cm、先端幅3mmです。

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