アガローススピンダウンアッセイ:組織学的解析のためのオルガノイドを埋め込む技術

要約

出典:Lee, S. et al.患者前立腺癌骨転移標本およびその異種移植片に由来する三次元(3D)オルガノイドの確立と分析。J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、アガロースに3D前立腺がんオルガノイドを埋め込むためのスピンダウンアッセイを行っています。これらの埋め込みオルガノイドは、がんの成長と発生を研究するためのさらなる病理組織学的解析に使用できます。

プロトコル

1. 組織学のためのオルガノイドプロセシング:アガローススピンダウン法

>注:このプロトコルは、Vlachogiannisらによる以前の出版物から適応されています。私たちは、オルガノイドのすべての集団を成功裏に埋め込むために、アガロース包埋を含むステップを追加しました。

1. ウェルから既存のメディアを取り出します。基底膜ドームを吸引しないように注意してください。
2. 同量(ステップ1で除去した培地の量に等しい)の細胞回収溶液を添加し、4°Cで60分間インキュベー
トします。
3. ピペットで基底膜ドームを取り外し、ピペットチップで基底膜ドームを破砕します。解離したドームと細胞回収溶液を1.5 mLチューブに集めます。
4. 300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清(細胞回収溶液)を取り除きます。すべての上清を別々のチューブに保存し、最後のペレット化ステップでオルガノイドの存在が確認されるまで
保存します。
6. 必要な量の冷たいPBSを添加し(表1)、ペレットを機械的に乱すために静かに上下にピペット
で動かします。
7. 300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
8. 上清(PBS)を取り除きます。
9. ペレットを、4% PFAの4%PFAを室温で60分間、一致した容量(例:24ウェルプレート培養条件の24ウェルプレート培養条件のペレット1個につき500μL)で固定します。
10. 固定後、300 x gおよび4°Cで5分間遠心分離します。
11. 上清(PFA)を取り除きます。
12. PBSを適度な容量(例:24ウェルプレート培養条件のペレット1個につき500 μL、表1)で洗浄し、300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
13. 温かいアガロース(PBS中の2%アガロース)を調製します.
    手記： ここでは、凍結切片用の細胞ペレットを200 μLのOCTコンパウンドに直接再懸濁することができます。
14. 細胞ペレットを200 μLのアガロース(PBS中2%)に再懸濁します。
    1. アガロースを添加した直後、1 mLシリンジに取り付けた25 G針を使用して、細胞ペレットを1.5 mLチューブの壁からゆっくりと取り外します。図1に示すように、細胞ペレットが1.5 mLチューブの壁から物理的に剥離していないと、アガロース包埋プロセス中に細胞ペレットの全部または一部が失われるリスクがあります。
15. PBS中の2%アガロースが完全に固まるまで待ちます。
16. 固化したアガロースブロックを、1 mLシリンジに取り付けられた25 G針を使用して、1.5 mLチューブから取り外します。
17. 細胞ペレットを含む分離したアガロースブロックを新しい1.5 mLチューブに移します。
18. チューブに70%EtOHを充填し、組織の脱水およびパラフィン包埋のための従来のプロトコルを使用してさらに進行します。

表1:1つのドームに必要な播種密度、基底膜の体積、および中程度の体積

円 名 名 名 名 名 名

カルチャープレート	播種密度 (セル)	基底膜容量(μL)	ミディアム (μL)
48ウェル	25,000-50,000	20	250
24ウェル	50,000-250,000	40	500
6ウェル	50,000-250,000	40	2,000

結果

図1:アガロースの埋め込みを成功させるための重要なステップ。1.5mLチューブの壁から細胞ペレットを剥がすプロセス。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mLピペットマン	ギルソン	F123602
1 mLシリンジ	BDシリンジ	329654
1.5mLチューブ	スペクトラムラボ製品	941-11326-ATP083
25Gニードル	BDプレシジョングライドニードル	305122
4%パラホルムアルデヒド(PFA)	アルファ・アエサル	J61899
70%エタノール(EtOH)	VWRの	BDH1164-4LP
アガロース	ロンザ	50000
細胞培養プレート - 24ウェル	共演者	3524
細胞培養プレート - 48ウェル	共演者	3548
細胞培養プレート - 6ウェル	共演者	3516
細胞解離溶液、Accumax	イノベーティブ・セル・テクノロジーズ(株)	AM105
細胞回収ソリューション	コーニング	354253
セルスクレーパー	ザルシュテット	83円18
dPBSの	コーニング/セルグロ	21-031-履歴書
1 mL用ピペットチップ(ブルーチップ)	フィッシャーブランド レディチップ	21〜197〜85
小型テーブルトップ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002426
OCTコンパウンド	ティッシュテック	4583
ウォーターバス	フィッシャーSC	2320

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