アガローススピンダウンアッセイ:組織学的解析のためのオルガノイドを埋め込む技術

1. 組織学のためのオルガノイドプロセシング:アガローススピンダウン法

>注:このプロトコルは、Vlachogiannisらによる以前の出版物から適応されています。私たちは、オルガノイドのすべての集団を成功裏に埋め込むために、アガロース包埋を含むステップを追加しました。

1. ウェルから既存のメディアを取り出します。基底膜ドームを吸引しないように注意してください。
2. 同量(ステップ1で除去した培地の量に等しい)の細胞回収溶液を添加し、4°Cで60分間インキュベー
トします。
3. ピペットで基底膜ドームを取り外し、ピペットチップで基底膜ドームを破砕します。解離したドームと細胞回収溶液を1.5 mLチューブに集めます。
4. 300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
5. 上清(細胞回収溶液)を取り除きます。すべての上清を別々のチューブに保存し、最後のペレット化ステップでオルガノイドの存在が確認されるまで
保存します。
6. 必要な量の冷たいPBSを添加し(表1)、ペレットを機械的に乱すために静かに上下にピペット
で動かします。
7. 300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
8. 上清(PBS)を取り除きます。
9. ペレットを、4% PFAの4%PFAを室温で60分間、一致した容量(例:24ウェルプレート培養条件の24ウェルプレート培養条件のペレット1個につき500μL)で固定します。
10. 固定後、300 x gおよび4°Cで5分間遠心分離します。
11. 上清(PFA)を取り除きます。
12. PBSを適度な容量(例:24ウェルプレート培養条件のペレット1個につき500 μL、表1)で洗浄し、300 x g、4°Cで5分間遠心分離します。
13. 温かいアガロース(PBS中の2%アガロース)を調製します.
    手記： ここでは、凍結切片用の細胞ペレットを200 μLのOCTコンパウンドに直接再懸濁することができます。
14. 細胞ペレットを200 μLのアガロース(PBS中2%)に再懸濁します。
    1. アガロースを添加した直後、1 mLシリンジに取り付けた25 G針を使用して、細胞ペレットを1.5 mLチューブの壁からゆっくりと取り外します。図1に示すように、細胞ペレットが1.5 mLチューブの壁から物理的に剥離していないと、アガロース包埋プロセス中に細胞ペレットの全部または一部が失われるリスクがあります。
15. PBS中の2%アガロースが完全に固まるまで待ちます。
16. 固化したアガロースブロックを、1 mLシリンジに取り付けられた25 G針を使用して、1.5 mLチューブから取り外します。
17. 細胞ペレットを含む分離したアガロースブロックを新しい1.5 mLチューブに移します。
18. チューブに70%EtOHを充填し、組織の脱水およびパラフィン包埋のための従来のプロトコルを使用してさらに進行します。

表1:1つのドームに必要な播種密度、基底膜の体積、および中程度の体積

図1:アガロースの埋め込みを成功させるための重要なステップ。1.5mLチューブの壁から細胞ペレットを剥がすプロセス。