前立腺オルガノイドアッセイ:前立腺上皮細胞の分化能力を研究するためのマトリックスゲルリングベースのex vivo培養技術

要約

出典:Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、マトリックスゲルリングベースの培養技術を使用して、単離されたマウス前立腺上皮細胞の培養を実演します。このアプローチは、遺伝的または薬理学的操作に応答して前立腺上皮細胞が3D腺構造を形成する分化能力に関する補完的な情報を提供できます。

プロトコル

1. 選別した前立腺上皮細胞の初代マウスオルガノイド培養へのプレーティング — タイミング: 2-3 H (Poly-HEMAコーティングプレート調製を除く)

>注:プレートは、マトリックスゲルの下のウェルの表面に2Dコロニーが形成されるのを防ぐために、Poly-HEMAでコーティングされています。選別された基底細胞または管腔前立腺上皮細胞をマウスオルガノイド培養物にプレーティングする1日前に、Poly-HEMAコーティングプレートを調製します。減少成長因子マトリックスゲル(以下、マトリックスゲルと呼ぶ)の1mLアリコートを、ステップ1.1の2時間前に氷上で解凍します。Y-27632(ROCK阻害剤)は、ステップ1.1の直前にマウスオルガノイド培地に追加する必要があります。氷上で手順1.1〜1.8を実行します。

1. 5 mLの丸底チューブに細胞をペレット化し、800 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
2. 細胞ペレットを500 μLのマウスオルガノイド培地で洗浄します(表1)。
3. 細胞を800 x gで4°Cで5分間遠心分離してペレット化し、上清を吸引します。
4. マウスオルガノイド培地に細胞密度1,000細胞/μLで再懸濁します。
5. マスターミックスを調製するには、マウスオルガノイド培地に懸濁した上皮細胞をマトリックスゲルと混合し、25%の細胞/培地と75%のマトリックスゲルを含む最終混合物を生成します。基底細胞は通常、100〜2,000細胞/80μLの濃度でプレーティングされますが、管腔細胞は通常、2,000〜10,000細胞/80μLの濃度でプレーティングされます。めっきされるセルの密度は、予想される材料収集の日と目的の下流アプリケーションによって異なります
   注:マスターミックス調製の5分前に、予想されるマスターミックス量に適したサイズのチューブを冷やします。取り扱い中にマトリックスゲルが固まらないようにするには、マトリックスゲルを新しいチューブに移す前に、ピペットチップを3〜4回ピペッティングして冷やすことが重要です。
6. 24ウェルプレートのウェルあたり80 μLのマトリックスゲル/細胞混合物を添加します。Poly-HEMAコーティングとの直接接触を避けながら、ウェルの壁の下半分に液滴をピペッティングすることをお勧めします。マトリックスゲルを添加した後、プレートを渦巻かせて、マトリックスゲル/細胞混合物がウェルの縁の周りにリングを形成するようにします。
7. 24ウェルプレートを37°Cの5%CO₂インキュベーターの右側を上にして10分間置き、マトリックスゲルを部分的に硬化させます
   注:24ウェルプレートをインキュベーターに置いた直後に、マウスオルガノイド培地を37°Cで加温し始めます。
8. 10分間インキュベートした後、24ウェルプレートを逆さまにしてさらに50分間インキュベートし、マトリックスゲルが完全に硬化するまで待ちます。
9. 予め温めたマウスオルガノイド培地350μLを各ウェルの中央に滴下します
   注:マトリックスゲルの完全性を維持するためには、培地を添加する際にマトリックスゲルリングを避けることが重要です。
10. 培地を添加した後、24ウェルプレートを37°Cの5%_CO2インキュベーターに戻します。

2. マウスオルガノイド培地の補充 — タイミング: 24 ウェルプレートあたり 10-15 分

>注:既存のメディアは48時間ごとに新しいメディアと交換する必要があります。各培地を交換する前に、マウスオルガノイド培地を温めておきます。補充に使用する培地にROCK阻害剤を添加する必要はありません。

1. 24ウェルプレートを45°の角度で傾け、マトリックスゲルリングを避けながら、P1000ピペットを使用して各ウェルの中心から既存の培地を静かに取り出します。
2. ステップ1.9と同様に、予め温めたマウスオルガノイド培地350 μLを添加します。5日以上培養したオルガノイドには、主要な栄養素や成長因子の急速な枯渇を防ぐために、より多くの培地(最大1 mL)を添加することをお勧めします。

>表1:マウスオルガノイド培地の調製方法

コンポーネント	濃度
B-27	1倍(50倍濃縮液から希釈)
グルタマックス	1倍(100倍濃縮物から希釈)
N-アセチル-L-システイン	1.25 mM
ノルモシン	50 μg/mL
組換えヒトEGF、アニマルフリー	50 ng/mL
組換えヒトノギン	100 ng/mL
R-spondin 1コンディショニング培地	10%コンディショニングメディア
A83-01	200 nM
DHTの	1 nM
Y-27632 二塩酸塩(ROCK阻害剤)	10 μM
アドバンスドDMEM/F-12	ベースメディア
R-spondin 1 で条件付けされた媒体は、Drost et al. で説明されているように生成されます。すべての成分を添加した後、0.22 μmフィルターを使用してマウスオルガノイド培地をフィルター滅菌します。ROCK阻害剤は、培養の確立とオルガノイドの継代中にのみ添加されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	F8667
B-27サプリメント(50倍)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
アドバンスドDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12634010
μ皿35 mm、高さ	イビディ	81156
マトリゲルGFRメンブレンマトリックス	コーニング	CB-40230Cの
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15〜140〜122
ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(ポリHEMA)	シグマ	P3932-25Gの
Y-27632 二塩酸塩(ROCK阻害剤)	セレックケミカル	S1049-50MG
A83-01	トクリス	2939
(ジヒドロ)テストステロン(5αアンドロスタン-17β-オール-3-オン)	シグマ	A-8380
グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061
ノルモシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	アント-NR-1
組換えヒトEGF、アニマルフリー	ペプロテック	AF-100-15
組換えヒトノギン	ペプロテック	120-10C
RPMI 1640 ミディアム、HEPES (cs of 10)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22400105
HOLTホスファターゼ阻害剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78428
コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	11836145001
トリトンX-100	シグマ	100-5ML倍
ソニックメモリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	FB120

シリーズ 名 の