タンパク質ライセート抽出:オルガノイドを溶解して細胞タンパク質を収集する技術

要約

出典:Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、基底膜マトリックスリングで培養した前立腺オルガノイドからのタンパク質ライセートの抽出を実演します。抽出したタンパク質画分の分析は、オルガノイドにおける系統マーカー発現の研究に役立ちます。

プロトコル

1. ウェスタンブロット分析のための前立腺オルガノイドからのタンパク質溶解物の抽出 — タイミング: 2.5-4 H

>注:タンパク質溶解物抽出用のオルガノイドを収集する前に、ディスパーゼ含有培地を準備して温めてください（表1）。

1. 24ウェルプレートを45°の角度で傾け、マトリックスゲルリングを避けながらP1000ピペットを使用して各ウェルの中心から既存の培地を静かに除去することにより、各ウェルから培地を取り出します。
2. オルガノイドを採取するには、1 mLのディスパーゼ含有培地をマトリックスゲルリングに直接ピペッティングしてマトリックスゲル全体を取り外すまで繰り返しブラストし、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
   注:Poly-HEMAコーティングされたウェルとの直接接触を避けることが重要です。直接接触すると、採取した材料がポリHEMAに汚染され、細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があります。
3. 1.5 mLの微量遠心チューブを37°Cの5%CO₂インキュベーターに30分間から1時間入れ、ディスパーゼによるマトリックスゲルの完全な消化を可能にします。
4. オルガノイドを800 x gで5分間RTで遠心分離してペレット化し、マイクロピペットを使用して上清を除去します。
5. オルガノイドペレットにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、軽くフリックして再懸濁します。
   注:オルガノイドペレットを十分に再懸濁しないと、オルガノイド材料が残留ディスパーゼまたはマトリックスゲルで汚染される可能性があります。
6. オルガノイドを800 x gで5分間RTで遠心分離してペレット化し、マイクロピペットを使用して上清を除去します。
7. オルガノイドペレットを急速凍結するには、ドライアイスとメタノールを含む溶液に各チューブを入れます。チューブは、将来使用するまで-80°Cで保管してください。または、ステップ1.6の直後にタンパク質溶解物を抽出します。
8. 充填細胞容量10 μLあたり、オルガノイドペレットを100 μLのタンパク質溶解バッファー(表1)に再懸濁します。フリックして再懸濁します。
   注:急速凍結後に再開する場合は、ホスファターゼとプロテアーゼの活性を防ぐために溶解バッファーをすぐにサンプルに添加する必要があるため、-80°Cからサンプルを取り外す前にタンパク質溶解バッファーが解凍されていることを確認してください。
9. 氷上のタンパク質溶解バッファーでサンプルを少なくとも45分間インキュベートします><。 注:核タンパク質回収の効率を高めるために、氷上でインキュベーションする前に超音波処理することをお勧めします。ただし、超音波処理は必要ありません。超音波処理が行われない場合は、手順1.10に進みます。
   1. 超音波処理するには、チューブを湿った氷に沈め、音波除去器の先端を微量遠心チューブにそっと適用します。20kHzで40秒間超音波処理します。
10. 確立されたプロトコルに従ってウェスタンブロットに進みます。

>表1:主要な解決策の準備のための指示

レシピ
ディスパーゼ含有培地	1 mg/mL ディスパーゼ + 10 μM ROCK 阻害剤 (進行性 DMEM F12)。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
解離メディア	RPMI 1640中の10%FBS + 1xペニシリン-ストレプトマイシン。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
タンパク質溶解バッファー	RIPAバッファー+ホスファターゼ阻害剤+プロテアーゼ阻害剤
ブロッキングソリューション	PBS中の10%FBS、0.2%Triton X-100

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A83-01	トクリス	2939
アドバンスドDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12634010
B-27サプリメント(50倍)、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
ディスパーゼII、粉末	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17-105-041
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	F8667
GlutaMAX サーモ	フィッシャーサイエンティフィック	35050061
HOLTホスファターゼ阻害剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78428
マトリゲルGFRメンブレンマトリックス	コーニングCB-	40230°C
N-アセチル-L-システイン	シグマ	A9165の
ノルモシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	アント-NR-1
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/ mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15〜140〜122
ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (ポリヘマ)	シグマ	P3932-25Gの
ラジオ免疫沈降アッセイ (RIPAの)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PI89901
組換えヒトEGF、アニマルフリー	ペプロテック	AF-100-15
組換えヒトノギン	ペプロテック	120-10C
RPMI 1640 ミディアム、HEPES (cs of 10)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22400105
ソニックメモリー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	FB120
トリトンX-100	シグマ	100-5ML倍
Y-27632 二塩酸塩(ROCK阻害剤)	セレックケミカル	S1049-50MG

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