ホールマウント免疫蛍光イメージング:インタクトオルガノイドを評価するための固定および染色技術

要約

出典:Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、無傷の前立腺がんオルガノイドの免疫蛍光染色の技術と、ホールマウント共焦点顕微鏡によるそれらのイメージングについて説明しています。この手法は、基底細胞および管腔前立腺上皮細胞のex vivo分化能力を評価することを目的としています。

プロトコル

1. 全共焦点顕微鏡による免疫組織化学解析のための前立腺オルガノイドの固定と染色

1. 24ウェルプレートからの前立腺オルガノイドの採取 — タイミング:45-60 min
   注:共焦点顕微鏡検査のために前立腺オルガノイドを採取する場合、その構造を維持するために注意して取り扱うことが重要です。以下の収集プロトコルは、単離中のオルガノイド構造の混乱を減らすように設計されています。
   1. オルガノイドを含むプレートの各ウェルから培地を取り出し、プレートを45°の角度で傾けます。
   2. マトリックスゲルを500 μLのディスパーゼ含有培地(表1)と37 °Cの5% CO₂インキュベーターで30分間インキュベートして消化します。
   3. 消化したオルガノイド懸濁液を微量遠心チューブに集め、オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット
   化します。
2. 前立腺オルガノイドのホールマウント免疫蛍光染色 — タイミング:3-4日(1-5時間/日)
   1. PBSに500 μLの4%パラホルムアルデヒドを加え、RTで2時間インキュベートし、穏やかに振とうします。
   2. オルガノイドを800 x gで3分間遠心分離し、室温でペレット化し、上清を取り除き、ペレットを1 mLのPBSで15分間穏やかに振とうしながら洗浄します。
   3. ステップ1.2.2と同様に、ペレットをさらに2回洗浄します。
   4. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。ブロッキング溶液に1 μg/mL DAPIを添加します(表1)。室温で2時間インキュベートするか、または4°Cで一晩、穏やかに振とうしながらインキュベー
   トします。
   5. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。一次抗体(ウサギ抗p63、マウス抗サイトケラチン8)をブロッキング溶液に添加し、4°Cで穏やかに振盪しながら一晩インキュベー
   トします。
   6. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。ペレットをPBS1mLで15分間、穏やかに振って洗浄します。
   7. ステップ1.2.6と同様に、ペレットをさらに2回洗浄します。
   8. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG-Alexa Fluor 594、ヤギ抗マウスIgG-Alexa Fluor 488)をブロッキング溶液に添加し、4°Cで一晩静かに振とうしながらインキュベー
   トします。
   9. オルガノイドを800 x gで3分間遠心分離し、室温でペレット化し、上清を取り除き、ペレットを1 mLのPBSで15分間穏やかに振とうしながら洗浄します。
   10. ステップ1.2.9のようにペレットをさらに2回洗浄します。

2. 全共焦点顕微鏡法のための染色された前立腺オルガノイドの組織透明化とマウント — タイミング: 7 時間

1. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。
2. PBS中の30%スクロース1 mLを1% Triton X-100と共に加え、室温で2時間静かに振とうしながらインキュベー
トします。
3. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。
4. PBS中の45%スクロース1 mLを1% Triton X-100と共に加え、室温で2時間静かに振とうしながらインキュベー
トします。
5. オルガノイドを800 x gで3分間RTで遠心分離してペレット化し、上清を除去します。
6. PBS中の60%スクロース1 mLを1% Triton X-100と共に加え、室温で2時間静かに振とうしながらインキュベー
トします。
7. オルガノイドを800 x gで3分間遠心分離し、室温でペレット化し、上清の95%を除去します
   注:スクロースの濃度が高くなると、ペレットは緩くなります。DAPI染色したオルガノイドを紫外線の下で観察し、上清の除去中にオルガノイドが失われていないことを確認することをお勧めします。
8. 残りの懸濁液の10-20μLの液滴をチャンバーカバーガラスに移し、共焦点顕微鏡に進みます
   注意: カバースリップの破片は、液滴の両側に置いてスペーサーとして使用できます(図1C)。これらは、液滴の上にカバースリップを置いたときにオルガノイドが崩壊するのを防ぎます。

>表1:主要な解決策の準備のための指示

コンポーネント	濃度
B-27	1倍(50倍濃縮液から希釈)
グルタマックス	1倍(100倍濃縮物から希釈)
N-アセチル-L-システイン	1.25 mM
ノルモシン	50 μg/mL
組換えヒトEGF、アニマルフリー	50 ng/mL
組換えヒトノギン	100 ng/mL
R-spondin 1コンディショニング培地	10%コンディショニングメディア
A83-01	200 nM
DHTの	1 nM
Y-27632 二塩酸塩(ROCK阻害剤)	10 μM
アドバンスドDMEM/F-12	ベースメディア
R-spondin 1-条件付け培地は、Drostらで説明されているように生成されます。すべての成分を添加した後、0.22 μmフィルターを使用してマウスオルガノイド培地をフィルター滅菌します。ROCK阻害剤は、培養の確立とオルガノイドの継代中にのみ添加されます。

結果

図1:ウェスタンブロットおよびホールマウント共焦点顕微鏡による前立腺オルガノイドの系統マーカー発現の解析。(A)7日間の培養後の基礎由来オルガノイド(上)と管腔由来オルガノイド(下)の代表的な位相コントラスト画像。スケールバー = 100 μm. (B) 5日間の培養後の基礎由来(Bas)および管腔由来(Lum)オルガノイドのウェスタンブロット分析。基礎マーカーであるサイトケラチン5(K5)、管腔マーカーであるサイトケラチン8(K8)、およびローディングコントロールであるヒストンH3(HH3)の染色。(C)スペーサー付きのチャンバーカバースリップを示す概略図。(D)7日間の培養後の基礎オルガノイド(上)および管腔由来オルガノイド(下)の代表的な微分干渉コントラス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16% パラホルムアルデヒド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50-980-487
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306
アドバンスドDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12634010
ディスパーゼII、粉末	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17-105-041
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	F8667
ヤギ抗マウスIgG-Alexa Fluor 488	インビトゲン	A28175 (英語)
ヤギ抗ウサギIgG-Alexa Fluor 594	インビトゲン	A11012(英語)
マウス抗サイトケラチン8	バイオレジェンド	904804
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15〜140〜122
ウサギ抗p63	バイオレジェンド	619002
RPMI 1640 ミディアム、HEPES (cs of 10)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22400105
蔗糖	シグマ	S0389-500G
トリトンX-100	シグマ	100-5ML倍