官能基化されたワイヤーベースの標的細胞単離:スパイク末梢血から癌細胞を単離するためのex vivo技術

>注:このプロトコルは、PBSまたはHT-29細胞と末梢血の人工混合物からのHT-29細胞(ヒト結腸癌細胞株)の単離について説明しています。同じ実験を2つの追加細胞株(LNCaPおよびVCaP)で実施し、理論的にはEpCAMを発現するすべての細胞で実施できます。

>1. ターゲット細胞の調製

1. 細胞培養と細胞の標識
   手記：このプロトコルでは、細胞を75cm²の培養フラスコで培養します。他の細胞培養装置(25cm²の培養皿、6ウェルプレートなど)を使用する場合は、それに応じて試薬の量を調整してください。使用するすべての液体は、ウォーターバスで37°Cに予熱されています。特に明記されていない場合、すべてのプロトコールステップは室温(RT)で実行されます。
   1. 2 mM L-グルタミン、20 mM Hepes、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMcCoy's 5a Modified MediumでHT-29細胞を37°C、5% CO₂雰囲気で培養します。
   2. 細胞が90%コンフルエントになったら、培地を取り出し、1x PBS10 mLで細胞をすすぎます。
   3. 細胞を回収するには、細胞に2 mLの細胞剥離溶液(Table of Materials and Reagents)を加え、細胞を37°Cで約5分間インキュベートします
      手記：剥離液には、1x PBS、0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および3 mg/Lフェノールレッドのタンパク質分解酵素とコラーゲン分解酵素が含まれています。細胞剥離溶液は37°Cで1時間後に不活性となるため、細胞剥離溶液の温加前時間を最小限に短縮し、細胞層全体を覆って最適な細胞剥離を得る。
   4. 倒立顕微鏡で細胞の剥離を確認します。
   5. 分離したすべての細胞を、10 mLの細胞培養培地(ステップ1.1.1で使用したものと同じ)をあらかじめ充填した50 mLチューブに移し、ピペッティングで細胞を再懸濁します。
   6. 残りのセル懸濁液をRTの水平ローラーミキサーに置き、ラベリングステップに進みます。
2. 標的細胞のライブセルラベリング
   1. 37°Cで予熱した1x PBSの1 mLに5 mM CFSE(ジメチルスルホキシド、DMSO)1 μLを希釈して、5 μMのすぐに使用できるCFSE標識溶液を得ます
      手記：最適な染色結果を得るには、新たに調製した溶液を使用してください。
   2. すぐに使用できるDNA染色溶液(Table of Materials and Reagents)を1x PBSで調製し、光から保護した2〜6°Cで保存します
      手記：最適な染色結果を得るには、新たに調製した溶液を使用してください。
   3. 水平ローラーミキサー(ステップ1.1.6)から細胞を取り出し、細胞を300 x gで10分間ペレット化し、上清を除去し、細胞を10 mLの1x PBSに再懸濁します。
   4. 細胞を1x PBSで再度すすぎ、細胞ペレットを500 μLのすぐに使用できるCFSE標識溶液に再懸濁します。
   5. 細胞を37°Cで15分間インキュベートし、300 x gで3分間遠心分離した後、細胞を回収します。
   6. 標識した細胞を温めた細胞培養液1 mLに再懸濁し、細胞を37°Cで30分間再生させます。
   7. 300 x gで3分間遠心分離して細胞を回収し、細胞ペレットを1 mLのすぐに使用できるDNA染色溶液に37°Cで10分間再懸濁します。
   8. 細胞をペレット化し、上清を取り除き、細胞を1x PBSの4 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞密度を評価し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルターを装備した蛍光顕微鏡を使用して蛍光標識を確認します(図1Aおよび1E)。
   9. 細胞を300 x gで3分間遠心分離し、次のセクションで示す各実験に必要な細胞密度に従って細胞ペレットを再懸濁し、氷上に置きます。

2. ワイヤーの充電

>注:細胞は、ミリリットルスケールで、またはマイクロリットルスケールで少数の細胞を提供することによって、標的細胞/末梢血のスパイクから単離することができます。前者のアプローチでは、末梢血中の希少細胞の状態を模倣することができますが、後者は、プロトコルの最適化/テストの目的で少数の細胞を接着するための好ましい方法である可能性があります。

1. 大量のセル懸濁液を使用してワイヤを充電する
   1. 0.8 gのBSAを40 mLの1x PBSに溶解して、2% BSAブロッキング溶液を調製します(細胞培養用)。BSAを最初のボルテックスで溶解し、その後RTで水平ローラーミキサーで10〜20分間インキュベートします。
   2. 空のEDTAチューブ/ヘパリンナトリウムチューブを2mLの2%BSAですすぎ、抗凝固剤の残留物を取り除き、溶液を廃棄します。.15 rpmの水平ローラーミキサーで5 mLの2% BSAを室温でインキュベートし、チューブ表面を30分間インキュベートし、溶液を廃棄します。
   3. 標識細胞(セクション1.2)を100,000細胞/mLの密度に希釈し、5mLを使用してワイヤーを充電します。
   4. 標識細胞懸濁液5mL(合計500,000細胞)をチューブに加えます。細胞懸濁液を添加する際は気泡を避けてください。
   5. 収納コンパートメントからワイヤーとワイヤーを固定しているゴム製のキャップを取り外し、1x PBSですすいでください(図2)。
   6. シリンジ針(20G)を使用してEDTAチューブのゴムチューブキャップを貫通し(ステップ2.1.4.)、キャップがチューブに戻り、チューブが傾斜ローラーミキサーに置かれたときに機能部分が細胞懸濁液に完全に浸るようにワイヤーを挿入します
      手記：ワイヤーのトリプルヘリカル機能部分は、充電中ずっとセル懸濁液で覆う必要があります。
   7. 傾斜させたローラーミキサーでチューブを5rpmで30分間回転させ、セルがワイヤーに付着できるようにします。
   8. ワイヤーを5mLの1x PBSですすぎ、目視検査まで1x PBSを含む15mLチューブに2〜6°Cの暗所で保管します
      手記：ワイヤーの機能部分は、細胞を傷つけないように、常にPBSに沈める必要があります。
2. 末梢血との人工混合物から標的細胞を単離する(別の充電方法:2.1.大量のセル懸濁液を使用してワイヤーを充電する)
   1. 標識細胞(セクション1.2)を希釈して、細胞密度の高い細胞懸濁液(> 1,000,000細胞/mL)を得ることで、末梢血に添加する細胞懸濁液の量を低く抑えます。
   2. 末梢血5mLに500〜50万個の細胞を加え、チューブを反転させて混合します。
   3. 収納コンパートメントからワイヤーを取り外し、ワイヤーを固定しているゴム製のキャップを取り外し、1x PBSですすいでください。
   4. シリンジ針(20 G)を使用して、デバイスの機能していない部分で新しいチューブキャップを貫通し、キャップがチューブに戻り、チューブが傾斜したローラーミキサーに置かれたときに機能部分がスパイクされた血液に完全に浸るようにします
      手記：ワイヤーのトリプルヘリカル機能部分は、充電中ずっとセル懸濁液で覆う必要があります。
   5. 傾斜ローラーミキサーでチューブを5rpmでRTで30分間インキュベートします。
   6. ワイヤーを1x PBSで3回すすぎ、目視検査まで1x PBSを含む15mLチューブに暗所で保管します
      手記：ワイヤーの機能部分は、セルを傷つけないように常に水没させる必要があります。
3. 少量のセルサスペンションからワイヤーを充電する(2.1の代替充電方法)。大量のセル懸濁液を使用してワイヤーを充電する)
   1. 標識した細胞を1x PBSに1,000,000細胞/mLで再懸濁します。
   2. 150 mmの使い捨てガラスパスツールピペットをラックに水平に固定します。
   3. 収納コンパートメントからワイヤーを取り外しますが、ワイヤーを保持している黄色のゴム製キャップは保持しておきます。
   4. 機能化された部分がパスツールピペットの先端にくるように、ワイヤーをピペットに入れます。
      手記：ワイヤーの先端がパスツールピペットの先端から突き出ないようにしてください。パスツールピペットチップの後端をワイヤーを保持しているゴム製のキャップで差し込まないでください。しっかりと取り付けられていると、セルサスペンションを反対側からピペットチップにロードできなくなります。
   5. 細胞懸濁液15μLをパスツールピペットの先端にロードし、ワイヤーの官能基化部分を覆います。
   6. ワイヤーを10分間インキュベートし、組み立てたワイヤー/パスツールピペットチップを毎分手動で4回転させます。
   7. パスツールピペットチップからワイヤーを取り外し、5 mLの1x PBSですすぎ、1x PBSを含む15 mLチューブに2〜6°Cの暗所で目視検査まで保管します
      手記：機能部分は、細胞に害を与えないように、常に1x PBSに浸す必要があります。

>3. ネットワーク上のセルを数える

>注:セルを傷つけないように、ワイヤーの機能部分は常に1x PBSに沈めてください。

1. グリースペンを使用してスライドガラス上に長方形の領域を描き、500μLの1xPBSを追加します。
2. ワイヤーの機能していない部分を曲げてスライドガラスの上に置いて、機能部分が1x PBS.
   に浸るようにします 手記：長方形の領域と1x PBSのボリュームに合わせ、ワイヤの機能部分を完全に覆います。両面粘着テープを使用して、ワイヤーの機能しない部分をスライドに取り付けます。
3. ワイヤーの両側を目視検査して、キャプチャされたセルを列挙します(図1Bおよび1F).
   手記：細胞の存在は、DAPIおよびFITC用のフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して測定されます。ワイヤーの両側を検査し、セルの数を評価(セル数が多い場合)またはカウント(ワイヤーに取り付けられているセルの数が少ない場合にのみ実行可能)することができます。セルの列挙が不要な場合は、この手順をスキップできます。
4. スキャン後、1x PBSが入った15mLチューブにワイヤーを戻し、ワイヤーを暗所に保管します
   手記：ワイヤーの機能していない部分のほとんど(曲げ部分を含む)を切断して取り外すことができ、保管が容易になります。

>4. 標的細胞の剥離と回収

>注:細胞の分離は、分離後4時間以内に行う必要があります。

1. 1x PBSのmLあたり4 mgの放出緩衝液成分(Table of Materials and Reagents)を溶解し、0.2 μmの滅菌フィルターで溶液をろ過して、すぐに使用できる緩衝液を得ます
   手記：ワイヤーのポリマーは、抗EpCAM抗体で官能基化されたハイドロゲルで構成されており、EpCAM提示標的細胞への結合を可能にします。放出バッファーには、ヒドロゲルを切断できる炭素-酸素タンパク質分解酵素が含まれています。タンパク質分解性切断は、ポリマーの分解をもたらし、その結果、捕捉細胞が剥離します。
2. リリースバッファーを37°Cで5分間予温します。
3. 1.6 mLのリリースバッファーを加えて、1.5 mLの反応チューブを満たします
   手記：1.5 mLの反応量用に設計されたチューブは、ワイヤーの機能部分を水没させるために必要な1.6 mLの塗布を可能にします。
4. ワイヤーの機能部分を37°Cのリリースバッファー(ウォーターバス)で20分間インキュベートします。チューブキャップの代わりにワイヤーに付属のゴムキャップを使用してワイヤーを1.5 mLチューブに固定し、ウォーターバスでのインキュベーション中の汚染を防ぎます。
5. ワイヤー/チューブアセンブリをRTおよび500rpmで15分間シェーカーに移します
   手記：シェーカーの軌道は1.5mmです。
6. ワイヤー/チューブアセンブリを遠心分離機に入れ、300 x gで10分間回転させます。
7. チューブからワイヤーを取り外し、キャップを閉じて、チューブを再度300 x gで10分間遠心分離します
   手記：ワイヤーは、暗所で2〜6°Cの1x PBSに保管して、セルカウントを行い、剥離効率を評価したり、ワイヤーに残っているセルをチェックしたりすることができます。
8. 細胞懸濁液の量を減らすには、上清の100 μL(マイクロマニピュレーション)または300 μL(細胞遠心分離およびその後のレーザーマイクロダイセクション)を除くすべてのものを取り除き、すぐにシングルセルサンプリングに進みます。

図1:ラベル付きセルの視覚化。(A,E)充電前の細胞:細胞をCFSEで標識し、CFSE(緑色)シグナル強度の範囲を示すDNAインターカレート色素で対比染色します。(B,F)ワイヤー上に捕捉された標識細胞。(C,G)細胞剥離手順後のワイヤー。(D,H)細胞をワイヤーから分離し、細胞遠心分離によりスライド上に回収しました。CFSE:FITCチャネル(緑)。DNA染色:DAPIチャネル(青)。

図2:図2:ワイヤーと収納コンパートメント。(A)ワイヤのコンパートメント、(B)機能化された部品の詳細。