マイクロマニピュレーションを用いたシングルセルサンプリング:がん細胞懸濁液からシングルセルを単離する技術

要約

出典: Chen S. et al. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、ターゲット細胞のプールから単一細胞を分離してダウンストリーム分析を行う手法について説明しています。この方法では、顕微鏡に取り付けたマイクロマニピュレーターを使用して、単一の標的細胞を高精度に分離します。

プロトコル

1. シングルセルサンプリング

1. マイクロマニピュレーション
   注:全ゲノム解析(WGA)などのダウンストリームアプリケーションを可能にするために、単離された単一細胞を2μLの細胞溶解マスターミックスに添加します。処理する細胞の数に応じてマスターミックスを調製します。ピペッティングによる損失の追加容量を計算し、Cell Lysis Master Mixを氷上に置きます。
   1. 細胞溶解マスターミックス(WGAキットの成分、材料および試薬の表)を調製します。簡単に説明すると、反応バッファー 2.0 μL 、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール 1.3 μL (10% 溶液)、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル) フェニルポリエチレングリコール 1.3 μL (10% 溶液)、プロテイナーゼ K 溶液 2.6 μL を混合し、RNase/DNase-free 水 12.8 μL を混合して、10 サンプルのマスターミックス (総容量 20 μL) を得ます
      手記：より多くのサンプルが必要な場合は、それに応じてボリュームを増やします。     
   2. グリースペンを使用して、セル懸濁液を所定の位置に保持する領域を描きます。細胞密度が高すぎる場合は、面積と体積を調整します(つまり、スライドガラス上のより大きな領域に印を付け、1x PBSと細胞懸濁液のアリコートをロードします)。
   3. 標的細胞懸濁液全体をスライドガラス上にピペットで移します。
   4. スライドガラスをマイクロマニピュレーターを搭載した顕微鏡に移します。細胞を5分間落ち着かせます。
   5. 2.0 μL の Cell Lysis Master Mix (ステップ 1.1.1. で調製) を充填した 0.2 mL PCR チューブを調製し、氷上に保存します。
   6. マイクロマニピュレーターを使用して1x PBSの1 μLに単一細胞を回収し、細胞溶解マスターミックスの入ったチューブに細胞を移します
      手記：マイクロマニピュレートした細胞を細胞溶解バッファーに移すには、キャピラリーを2 μLの溶解液に直接入れ、気泡が見えるまで排出します。
   7. 卓上マイクロフュージを使用して、サンプルを2000 x gで3秒間短時間スピンダウンし、チューブの底にあるすべての液体を収集します。サンプルを氷の上に置きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水 (1x PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010-015
バキュテナーEDTA(またはNa-ヘパリン)チューブ	BDの	366450 (または 366480)	標的細胞のex vivo捕捉のための反応チューブとして使用
パスツールピペット 150 mm	ボラック	D810	C&Rへのセルの少量適用に使用
グリースペン	ダコ	S2002	細胞懸濁液を所定の位置に保持するためにスライドガラスに使用
ミクロマニピュレーターMMJとCellTram varioを搭載したアクシバートM200	ツァイス/エッペンドルフ		手元でマイクロマニピュレーションを使用
マイクロキャピラリー(直径25μm)、CustomTip Type I	エッペンドルフ	930001201	細胞のマイクロマニピュレーションに使用
0.2 mL PCRチューブ	バイオザイム	710920

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