レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用したシングルセルサンプリング:不均一な細胞集団から標的細胞を回収する技術

要約

出典: Chen S. et al. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを使用して、不均一な細胞集団から単一の細胞を取得する技術について説明しています。単離された単一の細胞は、さらなるゲノム研究や癌研究に使用できます。

プロトコル

1. シングルセルサンプリング

1. レーザーマイクロダイセクション
   注:WGA用の4.5 μLのCell Lysis Master Mix(WGAキットの成分、材料表および試薬表)にシングルセルを添加します。
   1. Czyż et al.に従って、反応バッファー5.0 μL、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール1.3 μL(10%溶液)、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール(10%溶液)1.3 μLを混合し、それぞれ2.6 μLのプロテイナーゼK溶液と34.8 μLのRNase/DNaseフリー水を混合して、10サンプル(総容量45 μL)のマスターミックスを得ます。マスターミックスを氷の上に置きます.
      手記：より多くのサンプルが必要な場合は、それに応じてボリュームを増やします。
   2. レーザーマイクロダイセクションに適したメンブレンコーティングされたスライドをUV処理します。スライドをDNAクロスリンカーデバイスに入れ、最高濃度のUVに約10分間さらします。
   3. メンブレンコーティングされたスライドを細胞遠心分離機で組み立て、細胞懸濁液全体を300 x gで5分間サイトスピンします
      手記：液中システムを使用する場合、細胞をスライド溶液上に細胞遠心分離する場合は、細胞遠心分離後に上清を除去し、1140 x gで1分間ドライスピンを適用します。
   4. 直接レーザーマイクロダイセクションに進むか、サイトスピンを一晩風乾させ、サンプルを-20°Cで凍結して長期保存します。
   5. 4.5 μLの細胞溶解マスターミックスを0.2 mL PCRチューブのキャップにピペットで移し、レーザーマイクロダイセクションにより単一細胞を採取します。
   6. レーザーマイクロダイセクション顕微鏡からPCRチューブを取り出し、チューブを閉じます。チューブの底にすべての液体を短回転で集め、サンプルを氷の上に置きます。
   7. シングルセルWGAを続行するか、単離したサンプルを-80°Cで最大1か月間保存してから、さらに処理します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マッコイの5Aミディアム(1x)サプリとL-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16600-082	HT-29細胞に用いる培地は、実験に用いる細胞株に培地を適応
HEPES緩衝液(1 m)	PAAの	S11-001	マッコイズ5Aミディアムのサプリメント
ウシ胎児血清ゴールド	PAAの	A15-151	マッコイズ5aモディファイドメディウムのサプリメント
ペニシリン-ストレプトマイシン(100x)	バイオウエスト	L0018-100	マッコイズ5aモディファイドメディウムのサプリメント
リン酸緩衝生理食塩水 (1x PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010-015
アキュターゼ	バイオウエスト	L0950-100	細胞剥離液(細胞培養)
ウォーターバス	GFLの	タイプ1003	予温液に使用
孵卵器	サーモフィッシャーサイエンティフィック		細胞のインキュベート(細胞培養)に使用
50 mL 反応チューブ	VWRの	〒525-0403
ローラーミキサー	スチュアート・サイエンティフィック	SRT6Dの	セルが沈殿するのを防ぎながら、セルをワイヤに取り付けます
CellTrace CFSE 細胞増殖キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C34554	生細胞の標識(細胞質標識)に使用
ヘキスト33342	H3570-J	サーモフィッシャーサイエンティフィック	DNAの染色に使用(核酸対比染色)
遠心分離機(15 mLおよび50 mLの反応チューブを保持するために装備されています)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ヘレウス メガフージ 40R	細胞のペレット化に使用
Observer Z1 (蛍光/レーザーマイクロダイセクション顕微鏡)	カールツァイスマイクロイメージング		レーザー顕微鏡解剖が可能な倒立(免疫蛍光)顕微鏡。蛍光顕微鏡は、Hoechst 33342(DAPIフィルター)およびCFSE(FITCフィルター)を検出できなければなりません
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A4503-50Gの	ガラス/プラスチック表面のコーティングに使用
MS1 ミニシェーカー	シグマ・アルドリッチ	Z404039	ボルテックスに使用
Detektor CANCER03 DC03	ギルピ	ギル003	EpCAMpositive細胞(キャッチ&リリース、C&Rとも呼ばれる)を分離および剥離できる機能化ワイヤー
シリンジニードル(G20)	VWRの	〒613-0554	C&Rの機能していない部分が通じるようにゴム製のキャップに穴を開けるために使用される
ノイバウアーチャンバー	ロス	T729.1	セルのカウントに使用
パスツールピペット 150 mm	ボラック	D810	C&Rへのセルの少量適用に使用
グリースペン	ダコ	S2002	細胞懸濁液を所定の位置に保持するためにスライドガラスに使用
デルフィアプレートシェーカー	パーキン・エルマー	〒1296-003	細胞剥離時の攪拌に使用
1.5mLチューブ	エッペンドルフ	30,125,150
Ampli1 WGAキット	シリコンバイオシステムズ		Silicon Biosystemsから注文する
0.2 mL PCRチューブ	バイオザイム	710920
細胞遠心分離機および装置	ヘティヒ	ユニバーサル32	手元の細胞遠心分離機を使用
サーモサイクラー	バイオ・ラッド	DNAエンジンダイアド	加熱された蓋付きのすべてのサーモサイクラーを使用できます
マイクロ遠心分離機	ロス	CX73.1	手元にある卓上遠心分離機を使用
UVストラタリンカー1800	ストラタジーン	400072	DNAクロスリンカーを手元で使用

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