レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用したシングルセルサンプリング:不均一な細胞集団から標的細胞を回収する技術

1. シングルセルサンプリング

1. レーザーマイクロダイセクション
   注:WGA用の4.5 μLのCell Lysis Master Mix(WGAキットの成分、材料表および試薬表)にシングルセルを添加します。
   1. Czyż et al.に従って、反応バッファー5.0 μL、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール1.3 μL(10%溶液)、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール(10%溶液)1.3 μLを混合し、それぞれ2.6 μLのプロテイナーゼK溶液と34.8 μLのRNase/DNaseフリー水を混合して、10サンプル(総容量45 μL)のマスターミックスを得ます。マスターミックスを氷の上に置きます.
      手記：より多くのサンプルが必要な場合は、それに応じてボリュームを増やします。
   2. レーザーマイクロダイセクションに適したメンブレンコーティングされたスライドをUV処理します。スライドをDNAクロスリンカーデバイスに入れ、最高濃度のUVに約10分間さらします。
   3. メンブレンコーティングされたスライドを細胞遠心分離機で組み立て、細胞懸濁液全体を300 x gで5分間サイトスピンします
      手記：液中システムを使用する場合、細胞をスライド溶液上に細胞遠心分離する場合は、細胞遠心分離後に上清を除去し、1140 x gで1分間ドライスピンを適用します。
   4. 直接レーザーマイクロダイセクションに進むか、サイトスピンを一晩風乾させ、サンプルを-20°Cで凍結して長期保存します。
   5. 4.5 μLの細胞溶解マスターミックスを0.2 mL PCRチューブのキャップにピペットで移し、レーザーマイクロダイセクションにより単一細胞を採取します。
   6. レーザーマイクロダイセクション顕微鏡からPCRチューブを取り出し、チューブを閉じます。チューブの底にすべての液体を短回転で集め、サンプルを氷の上に置きます。
   7. シングルセルWGAを続行するか、単離したサンプルを-80°Cで最大1か月間保存してから、さらに処理します。