がん細胞の前立腺内注射:同所性前立腺がんモデルを確立するためのがん細胞送達技術

要約

出典:Anker, J. F. et al. Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、前立腺がん細胞の前立腺内注射をマウスモデルに投与する手順を実演します。同所性マウスモデルは、非侵襲的で臨床的に関連性のある環境で、疾患の原因と治療療法に対する反応を研究するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 術前のマウスの準備

>注:適切な適応を可能にし、動物のストレスを最小限に抑えるために、手術の少なくとも1週間前に大学の動物施設にハツカネズミを配置してください。ステップ1.1-1.6は、外科医の助手が行います。その後のすべての外科的ステップは、滅菌手袋と滅菌技術を備えた手術器具を使用して外科医によって行われます。

1. イソフルランでマウスを麻酔します(チャンバーを介した誘導の場合は2〜5%、ノーズコーンを介したメンテナンスの場合は1〜3%)。つま先のピンチ反射の喪失による完全な誘導を確認します。
2. マウスの体重を量り、少なくとも 0.05 mg/kg の鎮痛剤ブプレノルフィン s.c.
   を投与します。 手記： マウスの体重≥20 gは、前立腺内注射を成功させるのに理想的です。
3. 角膜の乾燥を防ぐために、両目に眼科用軟膏の潤滑剤を塗布します。
4. 腹部からすべての毛を剃ります。
5. 滅菌された非接着性パッドを使用して外科用スクラブを3回円形に塗布し、続いて滅菌アルコールワイプを使用して腹部を滅菌します。腹部を乾かします.
   手記：残りの外科的処置では、滅菌されたマウスの腹部に接触するために滅菌手袋と手術器具のみを使用する必要があります。
6. マウスを仰臥位にして、清潔な手術用顕微鏡の対物レンズの直下にある加熱パッドのきれいな表面に移します。
7. 腹部に小さな穴が開いた滅菌ドレープでマウスを覆います。

2. 前立腺内注射

>注:すべての外科的処置は無菌条件下で行ってください。顕微鏡、マウスの配置、またはその他の非滅菌物体の調整は、追加の支援を受けて行う必要があります。

1. 陰茎と包皮よりも上の腹部の正中線に沿って外側の皮膚を約1cm切開します(図1D)。
2. 層の間のはさみを開いて、外側の腹部の皮膚と内側の腹部の筋肉組織の間の結合組織を分離します。
3. 腸や膀胱に穴が開かないように、鉗子を使用して筋肉を持ち上げ、腹の内側の筋肉に対して同様の切開を行います(図1D)。
4. 両側の精嚢(図1A、白)/前立腺葉(図1A、黒)の1つを見つけます。これらは、多くの場合、後方、外側、および膀胱よりわずかに上にあります(図1A、黄色)が、これはマウス間で異なる場合があります。前立腺葉は半透明で、白い精嚢の湾曲が小さい方に付着しています。
5. Graefe組織鉗子を使用して精嚢の先端を静かに持ち上げ、精嚢に穴を開けずに組織に張力をかけます(図1E)。
6. 細胞がペレット化した可能性があるため、Myc-CaPマトリゲル溶液をジェンティーレピペッティング(外科医助手が実施)で混合し、気泡を避けるために30μL(1x10⁶細胞)を針にゆっくりと吸引します。
7. 前立腺葉の長軸に平行な針の斜角を慎重に挿入します。30μLをローブにゆっくりと注入し、その後、漏れを防ぐために針をゆっくりと引っ込めます(図1F)。前立腺葉の充血による適切な注射を確認します(図1G)。
8. 精嚢と前立腺葉をマウスの外側に慎重に保持し、マトリゲルが葉内で部分的に固まるようにします。この間、滅菌ポリエステル先端のアプリケーターを使用して腹部に漏れた細胞溶液を収集し、注射した前立腺葉を圧迫せずに非同所性腫瘍の発生を防ぎます。
9. 精嚢と注射した前立腺葉を、葉に圧力をかけずに慎重に腹部に戻します。.外部化された組織をすべて交換します。
10. 5-0ビクリル吸収性逆切断針縫合糸で内側の腹部の筋肉を閉じるために連続縫合を行います。
11. 4-0ナイロンモノフィラメント非吸収性逆切断針縫合糸で外側の腹部皮膚を閉じるために中断縫合を行います。手記：滅菌済みの9mmステープルを使用して、腹部の外側の皮膚を閉じることもできます。しかし、縫合糸とは対照的に、縫合糸はその後の生物発光および蛍光腫瘍イメージングシグナルを妨害します。
12. 滅菌エタノールワイプ(外科医の助手が開けた)ですべてのツールを洗浄し、ガラスビーズ滅菌器に30秒間置きます。次のマウスで使用する前にツールを乾かしてください。
13. シリンジと針を滅菌生理食塩水(外科医の助手によって開かれた)で洗い流し、残留マトリゲルによる目詰まりを防ぎます><。 手記：外科医の助手は、すべての手術に立ち会い、すべての非滅菌術前マウス調製と術後マウスケアを行い、注射前にMyc-CaPマトリゲル溶液を混合する必要があります。時間を最小限に抑えるために、各前立腺内マウス処置には20〜30分かかるため、外科医が現在のマウスを縫合しているとき、外科医助手は次のマウスの準備を開始できます。

>3. 術後のマウスケア

1. 鎮痛剤メロキシカムSCの1 mg / kgをすぐに、手術後24時間、および48時間後に投与します。.
2. マウスがケージ内で回復するのを待ちます。寝具は加熱パッドの半分に置かれていません。手術後少なくとも30分間、マウスが正常な可動性と活動を取り戻すまでマウスを監視し、その後、ケージの床に餌を置いた清潔なケージに入れます。
3. さらに、適切な創傷治癒、体重、グルーミング、および手術後の歩行について、マウスを毎日監視します。戦いの証拠があれば、マウスを個々のケージに分けます。
4. 手術後14日以内に残っている縫合糸をすべて取り除きます。

結果

図 1:前立腺葉、リンパ節の排出、および前立腺細胞内注射の代表的な技術。(A)右前立腺前立腺葉(黒、*)、付着した右精嚢(白)、右睾丸と脂肪パッド(緑)、膀胱(黄色)、(B)両側前立腺ドレイン傍大動脈リンパ節(オレンジ)、(C)マイクロ解剖ハサミ、Graefe鉗子、Graefe組織鉗子、縫合カッター付きニードルホルダー、28ゲージ針付き50μLシリンジ(左から右)、 (D)正中線切開、(E)精嚢および前立腺葉の外部化、(F)前立腺内注射、および(G)前立腺葉の充血。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Myc-CaP細胞株	ATCCの	CRL-3255	使用前にマイコプラズマフリーであることを確認してください
マイクロ解剖ハサミ	ロボズ	RS-5910
グレージ鉗子	ロボズ	RS-5135
Graefe組織鉗子	ロボズ	RS-5150
Olsen-Hegar ニードルホルダー with 縫合カッター	FSTの	12002年12月
50 μL シリンジ 705 RN SYR	ハミルトン	〒7637-01	エチレンオキシドガスによる滅菌
28ゲージニードルスモールハブRNH	ハミルトン	7803から02	ポイントスタイル4、角度45°、長さ0.75インチエチレンオキシドガスによる滅菌
RPMI(ルプミ)	ギブコ	18875-093
FBSの	ギブコ	〒10437-028
ペンシルリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
PBSの	ギブコ	14190-144
マトリゲル基底膜 マトリックス、フェノールレッドフリー、LDEVフリー	コーニング	356237	氷上で4°Cで一晩解凍 使用する前に
イソフルラン	ヘンリー・シャイン	〒11695-0500-2	ノースウェスタン大学比較医学センター(CCM)から取得
水塩化ブプレノルフィン 0.3 mg/mL		12496-0757-5	規制物質、後天性 ノースウェスタン大学CCMから
26 5/8ゲージシリンジ	BDの	309597	メロキシカムとブプレノルフィン注射用
眼科用軟膏潤滑剤	アクロン	17478-162-35
ベタジン外科用スクラブ(ポビドネヨージン、7.5%)	パデュー製品	67618-151-16
滅菌非粘着性パッド	ムーアメディカル	10775
滅菌アルコールワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-750
手術顕微鏡 Stemi DV4	ツァイス
滅菌ポリエステルチップ付きアプリケーター	ピューリタン	25-806 1PD
5-0ビクリル吸収性逆切断針縫合糸	e縫合糸	J493Gの
4-0ナイロンモンフィラメント非吸収性逆切断針縫合糸	e縫合糸	699H
ガラスビーズ滅菌器	ファインサイエンスツール	18000-45
滅菌生理食塩水0.9%塩化ナトリウム	ホスピーラ	0409-4888-02

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