化学療法抵抗性前立腺癌細胞の作製:in vitroで薬剤耐性癌細胞を得るための手順

要約

出典:Mohr, L. et al.抗有糸分裂剤ドセタキセルに対する耐性の前立腺癌細胞モデルの生成。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、前立腺癌のタキサン耐性細胞モデルを生成するためのプロトコルについて説明しています。これらのモデルは、前立腺がん患者におけるドセタキセル耐性への進行に関与する経路を研究するのに役立ちます。

プロトコル

1. ドセタキセル耐性前立腺癌細胞の作製

>注:IC50薬物濃度の測定に使用されるドセタキセル溶液ストックを使用して細胞処理を行います(実験用に十分なストックを事前に準備してください)。親細胞は、全手順を通じて小さなフラスコで並行して増殖させ、ドセタキセル処理フラスコで使用される量を模倣した対応する量でビヒクル(DMSO)に曝露する必要があります。

1. 20 mLの培地(DU145の場合はフラスコあたり3.5 x 10⁶細胞、22Rv1の場合はフラスコあたり6.5 x 10⁶細胞)を含む150 cm²フラスコにDU145または22Rv1細胞をプレートします。10〜20個の細胞フラスコを使用して、プロトコルの最後に十分な細胞を確保することをお勧めします。
2. 24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエンス(図1B、ドセタキセル前)にあるとき、IC50濃度(このプロトコルに記載されている細胞については5nM)でドセタキセルを添加します。
3. 72時間後、薬物含有培地を吸引し、ドセタキセルを含まない新鮮な培地を添加します(図1B、ドセタキセルの72時間後)。メディアは3〜4日ごとに交換してください。約1〜2週間以内に、耐性クローンが顕微鏡下で明らかになります(ドセタキセルの7日後および14日後、図1B)。
4. 培地を吸引し、15 mLのPBSで細胞を慎重に洗浄し、4 mLの0.05%トリプシン-EDTAと37°Cで3〜5分間インキュベートして、フラスコ表面から細胞を剥離します。
5. トリプシン処理した細胞を8 mLの新鮮な培地を使用してフラスコから再懸濁します。処理されたすべてのフラスコから細胞をプールします。遠心分離(300 x g、3分、RT)による細胞のペレット化。
6. 上清を取り除き、細胞ペレットを20mLの新鮮な培地に再懸濁し、150 cm²フラスコ(DU145の場合はフラスコあたり3.5 x 10⁶細胞、22Rv1の場合はフラスコあたり6.5 x 10⁶細胞)に細胞をプレートします。
7. 24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントにあるとき、5 nMドセタキセル(初期IC50濃度)を再度追加します。
8. 3日目に手順1.3から1.6を繰り返します。
9. 24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントにあるとき、2X IC50ドセタキセル濃度(このプロトコルに記載されている細胞については10 nM)でそれらを処理します。
10. ドセタキセル濃度(25 nM、50 nM、100 nM、250 nM)の用量漸増に続いて、ステップ1.3から1.8を繰り返し、最終的な最高濃度でフラスコ内で増殖する細胞の安定した集団を生成します。高濃度の場合、用量漸増プロトコルは、1,000 nMの濃度に達するまで最大6か月間実施できます(図2A)。

結果

図1:ドセタキセル耐性前立腺がん細胞モデルシステムの生成。(A)親前立腺癌細胞株DU145および22Rv1におけるドセタキセルIC50の測定を示す図(プロトコルのステップ1)。細胞生存率の予想されるパーセンテージと、必要なドセタキセルの用量漸増濃度が含まれています。代表的なDU145および22Rv1細胞生存率グラフは、ドセタキセル曝露の72時間後のIC50として5 nMを示しています。(B) ドセタキセル耐性の生成中に指定された時間における DU145 および 22Rv1 細胞の代表的な明視野顕微鏡画像 (プロトコルのステップ 2) は、実験は 3 倍で、データは SD ±平均を表します。赤い矢印は、プロトコール完了後のドセタキセル耐性クローンを示しています。スケールバー = 50 nm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DU145細胞	ATCCの	HTB-81
22Rv1セル	ATCCの	CRL-2505
ドセタキセル	セレックケミカルズ	S1148	DMSO(10mM)で
組織培養フラスコ 150cm^{2}	隼	355001
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875093	10%FBSと を補充 1%ペニシリン/ストレプトマイシン
ファンデーションBウシ胎児血清	双子座	900208
1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBSの)	コーニング	21-040センチ
0.05%トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25300-062
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122