機能的化学抵抗性特性評価:クローン生成アッセイを用いたがん細胞の薬剤耐性評価法

要約

出典:Mohr, L. et al.抗有糸分裂剤ドセタキセルに対する耐性の前立腺癌細胞モデルの生成。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、コロニー形成アッセイを使用して前立腺癌細胞の化学療法薬耐性を評価する方法を説明しています。このアッセイは、がん細胞における化学療法抵抗性の新規分子および細胞メカニズムを同定するための機能的ツールとして使用できます。

プロトコル

1. コロニー形成アッセイによる獲得ドセタキセル耐性の機能評価

>注:このプロトコルでは、コロニー形成アッセイを使用して化学療法抵抗性が評価されています。細胞生存率の評価に使用される代替方法(MTSアッセイなど)は、研究者の好みに基づいて使用することができます。

1. ウェルあたり2,000個の細胞(DU145または22Rv1、親細胞耐性とドセタキセル耐性の両方)を6ウェルプレートにプレートし、ウェルあたり2 mLの培地を使用します。
2. 24時間後、ドセタキセルの濃度を増やします(親細胞:0.25、0.5、1、2.5および5 nM;DR細胞:50、125、250、500、1,000 nM)。DU145細胞株と22Rv1細胞株の両方に対応します。DMSOは、ドセタキセルの最高用量に使用したのと同じ量のコントロールとして、1つのウェルにのみ添加します。
3. 72時間後、薬物含有培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.
4. 顕微鏡でコロニーが見えるまで、プレートを1〜2週間インキュベートします。
5. コロニーを染色するには、2〜3 mLのPBSでやさしく洗浄し、2〜3 mLのクリスタルバイオレット溶液(0.1%w/vの10%ホルマリン)で組織培養フードまたはヒュームフード内で20分間インキュベー
トします。
6. 染色液を取り出し、プレートを2〜3mLのH₂Oで洗浄し、H₂Oを除去し、プレートを風乾します。
7. ウェルを視覚化し、マーカーペンを使用して手動でコロニーをカウントすることで結果を分析し(同じコロニーを2回カウントしないようにするため)、細胞の生存率をグラフで表します。図を表現するためにプレートのデジタル画像を撮ります(図1A)。

結果

図1:ドセタキセル耐性細胞モデルの機能的および表現型の特徴付け。(A)示されたドセタキセル濃度で72時間処理した親細胞およびドセタキセル耐性細胞の代表的なコロニー形成アッセイ。各処理濃度のコロニーの割合は、含まれているグラフで表されます。スケールバー = 5 mm. (B) ABCB1、GATA2、CK19、およびCDH1のqRT-PCRによって定量化されたDR/親の相対mRNA倍増を示すのは、3回で、データはSD±平均を表しています。すべてのqPCR生データはActinに正規化されています(詳細はプロトコルを参照)。実験は三重で、データはSD±の平均を表します<。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DU145細胞	ATCCの	HTB-81
22Rv1セル	ATCCの	CRL-2505
ドセタキセル	セレックケミカルズ	S1148	DMSO(10mM)で
組織培養フラスコ150平方cm	隼	355001
6ウェル組織培養プレート	隼	353046
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875093	10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充
ファンデーションBウシ胎児血清	双子座	900208
1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	コーニング	21-040センチ
0.05%トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25300-062
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122
クリスタルバイオレット	シグマ・アルドリッチ	C0775
10%ホルマリン溶液	シグマ・アルドリッチ	HT501128