ADIによる前立腺がん細胞のオートファジー誘導:酵素を用いた細胞のオートファジー応答測定技術

1. ライブイメージングのための細胞の準備

1. 10% FBSおよび1%抗生物質を含むRPMI培地において、緑色蛍光タンパク質共役軽鎖3(LC3-GFP)を発現するCWR22Rv1細胞を、35 mmポリ-D-リジンコーティングガラス底培養皿上で増殖します。細胞は、急速な増殖を促進するのに十分な密度で播種する必要がありますが、イメージングまでに細胞が生い茂って凝集するほどではありません。
2. 選択した細胞サンプルをADI(0.3 μg/mL)のPBSで処理します。
3. イメージングの約1時間前に、1.5 μlのLysoTracker Red DND-99(Invitrogen、CA)を、10%FBSおよび1%抗生物質を含む20 mLのRPMIで希釈します。選択したサンプルには、アナログ・デバイセズを含む溶液を使用してください。すべての培地を37°Cに温めてから、培養皿に加えます。
4. LysoTracker Red DND-99を含むRPMIと細胞を37°Cで15〜45分間インキュベー
トします。
5. イメージングの約30分前に、WeatherStation環境エンクロージャーをオンにし、37°Cおよび5%CO₂(加湿空気を使用)に平衡化させます。
6. 細胞をPBSで洗浄し、培地を10%のFBSと1%の抗生物質のみを含む標準的なRPMIに置き換えてください。図のようにサンプルにアナログ・デバイセズを添加します。
7. 35 mmカバーガラス底の培養皿をカスタマイズされたアダプター(Applied Precision、Inc.、WA)に取り付け、顕微鏡ステージに配置します。60X 1.42 NA対物レンズに液浸油(屈折率1.520)を使用し、取り付けられた培養皿をステージ上に置きます。

2.超解像、構造化照明(OMX)顕微鏡

>注:このセクションのプロトコルは、OMX構造化照明顕微鏡(Applied Precision、WA)の使用に適用されます。

1. 主電源と目的のレーザー(410 nm、488 nm、および/または532 nm)をオンにします。レーザーが熱的に安定するまで20分待ちます。
2. 60X 1.42 NA対物レンズに液浸油(RTで固定サンプルの場合は屈折率1.516)を追加します。油滴に気泡が見られる場合は、対物レンズを清掃し、再度油を加えます。
3. サンプルスライドをステージに置き、必要に応じて、細胞がカバースリップに落ち着くまで10分間待ちます。
4. 集録プログラムを初期化します。蛍光照明を使用して、細胞の鮮明な輪郭が見えるまで焦点を調整します。
   手記：実際の画像取得まで、細胞の蛍光励起への曝露を最小限に抑えるために、常に注意を払う必要があります。
5. スパイラルモザイクスキャンを取得して、サンプルのより広い領域をプレビューし、関心のある細胞または領域を選択できます。サンプルのスキャンやターゲットの検索中は、短い露光時間(1〜10ミリ秒)と低励起電力(0.1〜1%の透過率)を使用することをお勧めします。
6. GFP-LC3蛍光によるオートファゴソームの同定。Alexa Fluor 555 anti-LAMP(リソソーム関連膜タンパク質)およびDAPI(固定サンプル)を用いた細胞核によるリソソームの同定。
7. 励起波長、画像領域(512x512など)、スタックの厚さ、露光時間、レーザー透過率などの実験条件を選択します。超解像画像の場合は、構造化照明オプションが有効になっていることを確認します。OMXでのデコンボリューション顕微鏡検査には、従来の照明オプションを選択します。
8. 最良の再構成結果を得るには、取得中に最大強度数が10,000〜15,000になるように実験条件を選択します。光退色が懸念される場合は、低露光量(5,000〜10,000個)でのイメージングを使用することができます。理想的には、取得全体でカウントが 2 倍を超えて減少しないようにし、4 倍を超える減少は避ける必要があります。必要に応じて、スタックの厚さを小さくして、強度カウントが持続するようにします。カメラは 64,000 カウントで飽和するため、最大強度がこれを超えないようにする必要があります。良好なサンプルの場合、実験条件は10~50ミリ秒の露光時間で、レーザー透過率は1%であることがわかりました。繰り返し画像化できる明るく光安定性の高いサンプルが好ましい。タイムラプス、超解像画像には安定した染色が必要です。
9. ノイズ低減のため、読み出し速度95MHz(中速オプション)、取得時間2msec以上を推奨します。再構成された画像では、取得中にサンプルが移動すると、アーチファクトが増加します。この効果のため、非接着性細胞または動きの速い細胞には短時間露光が推奨されます。
10. マルチチャンネルイメージングは、同時または順次実行できます。シーケンシャル モードはクロストークが少ないため、推奨されます。
11. 光退色を低減するために、一般的には最初に長い励起波長(532 nm、488 nm、次に410 nm)でイメージングすることをお勧めします。しかし、図1に示す実験結果では、この特定のサンプルの光安定性により、この順序が逆になっています(つまり、48 nm、532 nm、410 nm)。
12. Zスタックの上限/下限を設定するには、細胞の上部/下部がわずかに焦点が合っていないまで顕微鏡ステージを動かします。再構成ソフトウェアはこの値をデフォルトとして採用するため、超解像イメージングでは、各画像間の望ましい距離を0.125μmに一定に保つ必要があります。
13. SoftWorX(Applied Precision、WA)を使用して画像スタックを再構築し、VoloCITY 6.0(Perkin Elmer、MA)を使用して分析します。

図 1.細胞内のオートファゴソームとリソソームの分布。A. 上)DVモード(模擬広視野デコンボリューション、左)とOMX顕微鏡を用いた構造化照明モード(右)で取得し再構成した画像を並べて比較。スケールバーは5μmを表します。 B.下)オートファゴソームとリソソームの小規模な共局在(矢印で示されています)。