タンパク質抽出とタンパク質分解:前立腺腫瘍組織サンプルからのタンパク質の取得方法とペプチドへの酵素消化

要約

出典:Cheng, L. C. et al.前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調査するためのラベルフリー定量的質量分析と組み合わせたリン酸化ペプチド濃縮。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、前立腺腫瘍組織からペプチドを得るためのタンパク質抽出と消化の技術について説明しています。これらのペプチドをさらに分析することで、腫瘍治療の新規標的を特定するのに役立ちます。

プロトコル

1. タンパク質抽出

1. 溶解バッファーを調製します(表1)。(容量は、採取するサンプルの数によって異なります。
2. ティッシュの採取
   1. 腫瘍の重量を量り、培養試験管内の組織100 mgごとに2 mLの氷冷溶解バッファーを追加します。(通常、50〜150mgの組織湿重量が必要です。
3. ハンドヘルドまたはベンチトップホモジナイザーを使用してライセートをホモジナイズします(2xパルス15秒間)。ホモジナイザーは、最初のサンプルの前とサンプル間で、10%漂白剤、70%エタノール、および脱イオン水を連続して使用して洗浄します。
4. 還元してアルキル化するには、均質化したサンプルを95°Cで5分間加熱します。その後、氷の上で15分間冷やします。氷上で、ライセートを3回超音波処理します(つまり、パルス間に60秒の一時停止を挟んで30秒間パルスします)。この時点では、サンプルは粘性または塊状であってはなりません。ライセートを95°Cで5分間加熱します。
5. スイングバケツローターを使用して、スイングバケツローターを使用して同じ超音波処理チューブ内で溶解物を遠心分離し、15°Cで15分間、上清を収集し、ペレットを廃棄します。
6. Bradfordアッセイを実施してタンパク質濃度を決定します。必要に応じて、ライセートを溶解バッファーで5 mg/mLに希釈します。-20°C.
   で保存してください 注: ここで実験を一時停止できます。サンプルを-80°Cで凍結し、さらなる分析に使用します。

2. ライセートの消化

1. 100 mM Tris(pH = 8.5)を使用してサンプルを12倍に希釈し、グアニジンの量を減らします。すべてのサンプルを同じ容量に希釈して、不均等な分解の影響を最小限に抑えます。未消化のライセート12.5 μgを保存して、クマシー染色ゲルで確認します。
2. タンパク質5 mgについて、10 μgのリシルエンドペプチダーゼ(Lys-C)を加え、室温で5〜6時間インキュベートします。
3. 1 mg/mLのL-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン(TPCK)処理トリプシンを1 mM HCl(20 mM CaCl₂)に調製します。トリプシンを1:100のトリプシン:タンパク質比で添加し、37°Cで3時間インキュベー
トします。
4. 手順2.3と同じ量の新鮮なトリプシンを追加します。37°Cで一晩インキュベートします。
5. 12.5 μgの消化ライセートを保存して、Coomassie染色ゲルで完全な消化を確認します。

3. 逆相抽出

1. ライセートの量を記録します。15 mL 10 kDaカットオフフィルターを使用してサンプルをろ過します。スイングバケットローター(または固定角ローターの場合は3,500 x g)を使用して、15°Cでサンプルを3,500 x gで遠心分離し、保持液容量が250 μL未満になるまで遠心分離します(これには約45〜60分かかります)。フロースルーを収集し、保持物を廃棄します。

>表 1: バッファーとソリューション。この表は、このプロトコルで使用されるバッファーと溶液の組成を示しています。

ナトリウム

バッファ	容積	組成
6 M 塩化グアニジン溶解バッファー	50ミリリットル	6 M塩化グアニジン、100 mMトリスpH 8.5、10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、40 mMクロロアセトアミド、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、500 mg n-オクチルグリコシド、超純水(容量)
100 mM ピロリン酸ナトリウム	50ミリリットル	2.23 gピロリン酸ナトリウム十水和物、超純水(容量)
1M β-グリセロリン酸	50ミリリットル	15.31 g β-グリセロリン酸、超純水(容量)
5% トリフルオロ酢酸	20ミリリットル	100%トリフルオロ酢酸1mLを19mLの超純水に加えます
0.1%トリフルオロ酢酸	250ミリリットル	5 mL の 5% トリフルオロ酢酸を 245 mL の超純水に加えます
pY溶出バッファー	250ミリリットル	0.1% トリフルオロ酢酸、40% アセトニトリル、超純水容量
pST溶出バッファー	250ミリリットル	0.1% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリル、超純水容量
IP バインディング バッファー	200ミリリットル	50 mM トリス pH 7.4、50 mM 塩化ナトリウム、超純水
25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 7.5	10ミリリットル	19.7 mg を 10 mL の滅菌超純水に溶解し、pH を 7.5 に 1 N 塩酸 (~10-15 μL/10 ml 溶液) で溶解し、新鮮にします
1M リン酸バッファー、pH 7	1,000ミリリットル	423 mL 1 M リン酸二水素ナトリウム、577 mL 1 M リン酸水素
平衡化バッファー	14ミリリットル	アセトニトリル 6.3 mL、5% トリフルオロ酢酸 280 μL、乳酸 1740 μL、超純水 5.68 mL
リンスバッファー	20ミリリットル	アセトニトリル 9 mL、5% トリフルオロ酢酸 400 μL、超純水 10.6 mL
質量分析ソリューション	10ミリリットル	アセトニトリル 500 μL、5% トリフルオロ酢酸 200 μL、超純水 9.3 mL
バッファ A	250ミリリットル	5 mMリン酸一カリウム(pH 2.65)、30%アセトニトリル、5 mM塩化カリウム、超純水(容量)
バッファB	250ミリリットル	5 mM リン酸一カリウム (pH 2.65)、 30% アセトニトリル、 350 mM 塩化カリウム、 超純水 (容量内)
0.9%水酸化アンモニウム	10ミリリットル	29.42% 水酸化アンモニウム 300 μL 超純水 9.7 mL

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
超低温冷凍庫	パナソニック	MDF-U76Vの
冷凍庫-20°C	VWRの	SCPMF-2020
スイングローターバケット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004377
エンドオーバーエンドローテーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	415110質問
低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ	エッペンドルフ	22431081
トリプシン、TPCK処理	ワージントンバイオケミカルズ	LS003740
リシルエンドペプチダーゼ	和光純薬工業(株)	〒125-05061
ミリクウォーター			すべての溶液とバッファーの調製に使用される脱イオン水
ソニックメモリー	フィッシャーサイエンティフィック	FB-120	ソニケーター
ポリトロンシステムPT	キネマティカAG	PT 10-35 GT	ホモジナイザー