ペプチド精製:RP-HPLCを用いた消化タンパク質溶解物からのペプチド抽出技術

要約

出典:Cheng, L. C. et al.前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調査するためのラベルフリー定量的質量分析と組み合わせたリン酸化ペプチド濃縮。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、消化されたタンパク質溶解物混合物からペプチドを精製する逆相高速液体クロマトグラフィーのデモを行います。これらの精製されたペプチドは、凍結乾燥され、ダウンストリームアプリケーションのために保存されます。ペプチドの解析は、細胞シグナル伝達とがんに関与するメカニズムを理解するのに役立ちます。

プロトコル

1. 逆相抽出

1. ガラスバイアルに入った消化済みのタンパク質溶解物から始めます。15 mL 10 kDaカットオフフィルターを使用してサンプルをろ過します。スイングバケットローター(または固定角ローターの場合は3,500 x g)を使用して、15°Cでサンプルを3,500 x gで遠心分離し、保持液容量が250 μL未満になるまで遠心分離します(これには約45〜60分かかります)。フロースルーを収集し、保持物を廃棄します.
   NOTE:実験はここで一時停止できます。サンプルは後で使用するために-80°Cで凍結します。
2. サンプルを酸性化するには、ライセート1 mLあたり約20 μLの5%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えます。それらをよく混ぜ合わせ、pHストリップを使用してサンプルのpHを測定します。5% TFAを使用してpHを2.5に調整します。
3. C-18カラムの短い方の端をバキュームマニホールドに接続します。真空度を17〜34 kPaに設定します(または製造元の指示に従ってください)。ガラスピペットを使用して、100% アセトニトリル(ACN)の 3 mL をカラムに湿らせます。カラムを乾かさないでください。
4. ガラスピペットを使用して、6 mLの0.1% TFAを2×3 mLとして適用し、カラムを平衡化します。酸性化したサンプルをカラムにロードします。一度に3mL以上を追加しないでください。バキュームを1秒あたり約1〜2滴を目標に調整します。
5. ガラスピペットを使用して、9 mL の 0.1% TFA を 3 × 3 mL として適用した状態でカラムを洗浄します。2 mLの40% ACN、0.1% TFAでカラムを溶出します。2 mLのフラクション2個をガラス製培養チューブに集めます。列を破棄します。
6. 溶出液チューブをパラフィルムで覆い、20Gの針を使用してカバーに3〜5個の穴を開けます。溶出液が完全に固まるまで、溶出液をドライアイスで少なくとも30分間凍結します。
7. フラクションを一晩凍結乾燥します。翌日、凍結乾燥機を停止する前に、サンプルが完全に乾いていることを確認してください。チューブは、-80°Cの繊細なワイプが付いた50mLの円錐形チューブに保管します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
超低温冷凍庫	パナソニック	MDF-U76Vの
冷凍庫-20°C	VWRの	SCPMF-2020
スイングローターバケット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004377
バキュームマニホールド	レステック	26080
凍結乾燥機	ラブコンコ	7420020
CentriVap卓上型真空濃縮器	ラブコンコ	7810010
Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット	ミリポアシグマ	UFC901024
エンドオーバーエンドローテーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	415110質問
ガラス製培養チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14*961*26
パラフィルム	フィッシャーサイエンティフィック	13-374-12
20Gの針	BDの	B305175
キムワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A
スクリューキャップクライオチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	379189
Nunc 15 mL コニカルチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-565-268
低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ	エッペンドルフ	22431081
3 mLシリンジ	BDの	309657
トリフルオロ酢酸(TFA)	フィッシャーサイエンティフィック	PI-28904
アセトニトリル(ACN)	フィッシャーサイエンティフィック	A21-1
ミリクウォーター			すべての溶液とバッファーの調製に使用される脱イオン水