リン酸化ペプチド濃縮:複雑なペプチド混合物から特定のリン酸化ペプチドを分離するための抗体ベースの免疫沈降技術

要約

出典:Cheng, L. C., et al. Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、ペプチド混合物からリン酸化ペプチドの抗体ベースの免疫沈降を実演します。濃縮されたリン酸化ペプチドは真空濃縮され、下流の分析のために保存されます。

プロトコル

1. pYペプチドの免疫沈降と濃縮

1. 精製ペプチド消化物の凍結乾燥粉末を、各画分中の0.5 mLの氷冷免疫沈降(IP)結合バッファーで再懸濁します。0.5 mLの再懸濁液量を2番目のフラクションから最初のフラクションに移してフラクションをプールし、ピペットチップを保存します。(ピペッティングで上下する代わりに)激しくボルテックスして、サンプルが完全に溶解していることを確認してから、3.6 mLのスクリューキャップクライオチューブに移します。
2. 凍結乾燥チューブを、各チューブ内の別の0.5 mLのIP結合バッファー(表1)ですすいでください。同じピペットチップを使用して溶液を3.6 mLスクリューキャップチューブに移し、サンプルの損失を最小限に抑えます。すすぎをさらに1回繰り返し、最終再懸濁液量を2 mLにします(タンパク質5 mgの場合)。サンプルのpHを測定して、約7.4であることを確認します。酸性が強すぎる場合は、10 μL の 1M Tris (未滴定、pH ~11) を繰り返し添加します。塩基性が強すぎる場合は、10 μL の希薄な HCl (1:25 または 1:100) を繰り返し加えます。
3. pYビーズを事前に洗浄します(5 mgの開始ライセート用)
   1. サンプルあたり25 μgの4G10抗体と12.5 μgの27B10.4抗体が必要です。先端がカットされたp200ピペットを使用して抗体を別々の微量遠心チューブに移した後、450 μLの氷冷IP結合バッファーで抗体を2回洗浄します。それらを100 x gで4°Cで1分間遠心分離し、上清を吸引します。
   2. IP結合バッファーを使用して、ビーズをストック濃度0.5 mg/mLに再懸濁します。(ビーズを渦巻きにしないでください。必要なスラリー(1サンプルあたり50 μLの4G10抗体スラリーと25 μL 27B10.4抗体スラリー)を1本のチューブに分注した後、ストック遠心チューブを200 x gで4°Cで1分間スピンダウンします。サイドウォールを上清で洗浄してから、ビーズを冷蔵庫に戻します。
4. スクリューキャップクライオチューブに再懸濁したサンプル溶液に、事前に洗浄したpYビーズを加えます。4°Cでエンドオーバーエンドローテーターで一晩インキュベートします。
5. スクリューキャップクライオチューブを、繊細なワイプで裏打ちされた50mLの遠心分離チューブに入れます。ビーズを100 x gで1分間スピンダウンします。上清を保存し、pSTペプチドの濃縮に使用されます。
6. ビーズを300 μLのIP結合バッファーで再懸濁します。それらを2 mLの微量遠心チューブに移し、100 x gで4°Cで1分間スピンダウンします。
7. インキュベーションチューブを200 μLのIP結合バッファーで3回すすいでください。毎回同じ微量遠心チューブに内容物を移します。次に、それらをスピンダウンします。
8. 微量遠心チューブ内のビーズを500 μLのIP結合バッファーで3回洗浄し、100 x gで1分間スピンダウンします。次に、ビーズを450 μLの25 mM NH₄HCO₃、pH 7.5で4回洗浄し、100 x gで1分間スピンダウンします。毎回、粉末から新鮮な25 mM NH₄HCO₃溶液を使用してください。
9. ビーズを1,500 x gで1分間遠心分離し、ゲルローディングチップを使用して、ゲルローディングチップの先端をビーズの表面の少し下に浸して上清を完全に除去します。
ビーズ
10. に4倍の容量の0.1% TFAを添加します(つまり、75 μgのpYビーズスラリーに対して300 μLの0.1% TFAを添加します)。よく混ぜ合わせ、サーモミキサーで1,000 rpm、37°C、15分間インキュベー
トします。
11. 再懸濁液を0.2 μmスピンフィルターに移します。溶出チューブをすばやくスピンダウンし、P10ピペットを使用して残留量を同じスピンフィルターに移します。スピンフィルターを850 x gで1分間スピンダウンします。溶出液をタンパク質結合性の低い微量遠心チューブに移します。溶出液を40°Cで一晩中真空濃縮し、加熱時間300分
    手記：ここで実験を一時停止できます。サンプルを-80°Cで凍結し、後日続行します。

>表 1: バッファーとソリューション。この表は、このプロトコルで使用されるバッファーと溶液の組成を示しています。

ナトリウム

バッファ	容積	組成
6 M 塩化グアニジン溶解バッファー	50ミリリットル	6 M塩化グアニジン、100 mMトリスpH 8.5、10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、40 mMクロロアセトアミド、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、500 mg n-オクチルグリコシド、超純水(容量)
100 mM ピロリン酸ナトリウム	50ミリリットル	2.23 gピロリン酸ナトリウム十水和物、超純水(容量)
1M β-グリセロリン酸	50ミリリットル	15.31 g β-グリセロリン酸、超純水(容量)
5% トリフルオロ酢酸	20ミリリットル	100%トリフルオロ酢酸1mLを19mLの超純水に加えます
0.1%トリフルオロ酢酸	250ミリリットル	5 mL の 5% トリフルオロ酢酸を 245 mL の超純水に加えます
pY溶出バッファー	250ミリリットル	0.1% トリフルオロ酢酸、40% アセトニトリル、超純水容量
pST溶出バッファー	250ミリリットル	0.1%トリフルオロ酢酸、50%アセトニトリル、超純水(容量)
IP バインディング バッファー	200ミリリットル	50 mM トリス pH 7.4、50 mM 塩化ナトリウム、超純水
25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 7.5	10ミリリットル	19.7 mg を 10 mL の滅菌超純水に溶解し、pH を 7.5 に 1 N 塩酸 (~10-15 μL/10 ml 溶液) で溶解し、新鮮にします
1M リン酸バッファー、pH 7	1,000ミリリットル	423 mL 1 M リン酸二水素ナトリウム、577 mL 1 M リン酸水素
平衡化バッファー	14ミリリットル	アセトニトリル 6.3 mL、5% トリフルオロ酢酸 280 μL、乳酸 1740 μL、超純水 5.68 mL
リンスバッファー	20ミリリットル	アセトニトリル 9 mL、5% トリフルオロ酢酸 400 μL、超純水 10.6 mL
質量分析ソリューション	10ミリリットル	アセトニトリル 500 μL、5% トリフルオロ酢酸 200 μL、超純水 9.3 mL
バッファ A	250ミリリットル	5 mMリン酸一カリウム(pH 2.65)、30%アセトニトリル、5 mM塩化カリウム、超純水(容量)
バッファB	250ミリリットル	5 mM リン酸一カリウム (pH 2.65)、 30% アセトニトリル、 350 mM 塩化カリウム、 超純水 (容量内)
0.9%水酸化アンモニウム	10ミリリットル	29.42% 水酸化アンモニウム 300 μL 超純水 9.7 mL

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
凍結乾燥機	ラブコンコ	7420020
CentriVap卓上型真空濃縮器	ラブコンコ	7810010
キムワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A
ミリポア0.2μmスピンフィルター	ミリポアシグマ	UFC30GVNB
低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ	エッペンドルフ	22431081
抗ホスホチロシン、アガロース、クローン:4G10	ミリポアシグマ	16101
27B10.4	細胞骨格	APY03ビーズ
ペプチドアッセイキット	サーモサイエンティフィック	23275
トップヒント	ポリLC株式会社	TT200TIO 96月
SCXカラム(ポリスルホエチルA)	ポリLC株式会社	SPESE1203
3 mLシリンジ	BDの	309657
ミリクウォーター			すべての溶液とバッファーの調製に使用される脱イオン水
トリフルオロ酢酸(TFA)	フィッシャーサイエンティフィック	PI-28904
アセトニトリル(ACN)	フィッシャーサイエンティフィック	A21-1
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-500
乳酸	シグマ・アルドリッチ	69785から250ミリリットル
水酸化アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A669S-500
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-5

抗体