出典:Cheng, L. C. et al.前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調査するためのラベルフリー定量的質量分析と組み合わせたリン酸化ペプチド濃縮。J. Vis. Exp. (2018年)
このビデオは、前立腺腫瘍組織から抽出されたリン酸化ペプチドの二酸化チタンベースの濃縮を示しています。これらの濃縮リン酸化ペプチドは、前立腺がんの進行に関与する細胞シグナル伝達経路を理解するためのタンパク質特性評価などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。
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方法論記事
二酸化チタンによるリン酸化ペプチドの濃縮:ペプチドライブラリーからのリン酸化ペプチドの選択的単離法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
1. pYペプチドの二酸化チタン濃縮
- 乾燥したダウンリン酸化ペプチドを50% ACN、0.1% TFAの200 μLに再懸濁します。ボルテックスし、10,000 x gで30秒間遠心分離します。これを1回繰り返して、それらをしっかりと再懸濁します。
- 200 μLのサンプルを収容できるチップに含まれるTiO2ビーズの調製。
- 先端の小さな先端側を軽くたたいて、材料をその端に移動します。100% ACNを200 μL加えてチップをすすぎ、チップを反転させて小さい方の端をフリックして液体をキャップに向かって移動させます。
- かみそりの刃を使用して、先端の小さい方の端を切り取り、タンパク質結合性の低いチューブの上に置きます。(ポリスチレンチューブは、TiO2がチューブの側面にくっつくため、使用しないでください。キャップを外し、マイクロピペットを挿入して、残りのACNを突っ込みます。100% ACNの200 μLで洗浄を繰り返します。TiO2ビーズは、次のステップのために低タンパク質結合チューブに配置されます。
- TiO2を500 μLの100% ACN 2xで調製し、ピペットでビーズを溶媒と混合します。それらを100 x gで1分間遠心分離します。
- TiO2を500 μLの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH ~7)で2回、ビーズを300 μLの平衡緩衝液で3回洗浄します。TiO2は非常に密度が高いため、ビーズはすぐに沈殿します。
- 400 μL の 50% ACN、0.1% TFA を低タンパク質結合チューブに添加し、続いて 84 μL の乳酸を添加します。再懸濁したリン酸化ペプチドを低タンパク質結合チューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターを使用して室温で1時間インキュベートします。
- ビーズを100 x gで1分間遠心分離し、ペレット化します。300 μLの平衡化バッファー(表1)で2回洗浄し、100 x gで1分間スピンダウンします。
- ビーズを300 μLのリンスバッファーで2倍洗い、0.2 μmスピンフィルターに移します。1,500 x gで1分間回転させます。
- フィルターユニットを清潔な1.5mLの低タンパク質結合チューブに移します。H₂O溶液の0.9% NH₃ 200 μLで内容物を2回溶出し、10〜11のpHストリップでpHを測定します。溶出液を真空濃縮して一晩乾燥させ、アンモニアを蒸発させます。
表1:バッファーと溶液。この表は、このプロトコルで使用されるバッファーと溶液の組成を示しています。
ナトリウム| バッファ | 容積 | 組成 |
| 6 M 塩化グアニジン溶解バッファー | 50ミリリットル | 6 M塩化グアニジン、100 mMトリスpH 8.5、10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、40 mMクロロアセトアミド、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、500 mg n-オクチルグリコシド、超純水(容量) |
| 100 mM ピロリン酸ナトリウム | 50ミリリットル | 2.23 gピロリン酸ナトリウム十水和物、超純水(容量) |
| 1M β-グリセロリン酸 | 50ミリリットル | 15.31 g β-グリセロリン酸、超純水(容量) |
| 5% トリフルオロ酢酸 | 20ミリリットル | 100%トリフルオロ酢酸1mLを19mLの超純水に加えます |
| 0.1%トリフルオロ酢酸 | 250ミリリットル | 5 mL の 5% トリフルオロ酢酸を 245 mL の超純水に加えます |
| pY溶出バッファー | 250ミリリットル | 0.1% トリフルオロ酢酸、40% アセトニトリル、超純水容量 |
| pST溶出バッファー | 250ミリリットル | 0.1% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリル、超純水容量 |
| IP バインディング バッファー | 200ミリリットル | 50 mM トリス pH 7.4、50 mM 塩化ナトリウム、超純水 |
| 25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 7.5 | 10ミリリットル | 19.7 mg を 10 mL の滅菌超純水に溶解し、pH を 7.5 に 1 N 塩酸 (~10-15 μL/10 ml 溶液) で溶解し、新鮮にします |
| 1M リン酸バッファー、pH 7 | 1,000ミリリットル | 423 mL 1 M リン酸二水素ナトリウム、577 mL 1 M リン酸水素 |
| 平衡化バッファー | 14ミリリットル | アセトニトリル 6.3 mL、5% トリフルオロ酢酸 280 μL、乳酸 1740 μL、超純水 5.68 mL |
| リンスバッファー | 20ミリリットル | アセトニトリル 9 mL、5% トリフルオロ酢酸 400 μL、超純水 10.6 mL |
| 質量分析ソリューション | 10ミリリットル | アセトニトリル 500 μL、5% トリフルオロ酢酸 200 μL、超純水 9.3 mL |
| バッファ A | 250ミリリットル | 5 mMリン酸一カリウム(pH 2.65)、30%アセトニトリル、5 mM塩化カリウム、超純水(容量) |
| バッファB | 250ミリリットル | 5 mM リン酸一カリウム (pH 2.65)、 30% アセトニトリル、 350 mM 塩化カリウム、 超純水 (容量内) |
| 0.9%水酸化アンモニウム | 10ミリリットル | 29.42% 水酸化アンモニウム 300 μL 超純水 9.7 mL |
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| バキュームマニホールド | レステック | 26080 | |
| 凍結乾燥機 | ラブコンコ | 7420020 | |
| CentriVap卓上型真空濃縮器 | ラブコンコ | 7810010 | |
| エンドオーバーエンドローテーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 415110質問 | |
| カミソリの刃 | フィッシャーサイエンティフィック | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット | ミリポアシグマ | UFC901024 | |
| Nunc 15 mL コニカルチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-565-268 | |
| ミリポア0.2μmスピンフィルター | ミリポアシグマ | UFC30GVNB | |
| 低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ | エッペンドルフ | 22431081 | |
| 抗ホスホチロシン、アガロース、クローン:4G10 | ミリポアシグマ | 16101 | |
| ペプチドアッセイキット | サーモサイエンティフィック | 23275 | |
| トリフルオロ酢酸(TFA) | フィッシャーサイエンティフィック | PI-28904 | |
| アセトニトリル(ACN) | フィッシャーサイエンティフィック | A21-1 | |
| 乳酸 | シグマ・アルドリッチ | 69785から250ミリリットル | |
| 水酸化アンモニウム | フィッシャーサイエンティフィック | A669S-500 | |
| リン酸カリウム一塩基性 | フィッシャーサイエンティフィック | BP362-500 | |
| 塩化カリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP366-500 | |
| 塩化カルシウム二水和物 | フィッシャーサイエンティフィック | BP510-500 | |
| トリスベース | フィッシャーサイエンティフィック | BP152-5 | |
| モノチップ | ポリLC株式会社 | TT200TIO 96月 |
