二酸化チタンによるリン酸化ペプチドの濃縮:ペプチドライブラリーからのリン酸化ペプチドの選択的単離法

Abstract

出典:Cheng, L. C. et al.前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調査するためのラベルフリー定量的質量分析と組み合わせたリン酸化ペプチド濃縮。J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、前立腺腫瘍組織から抽出されたリン酸化ペプチドの二酸化チタンベースの濃縮を示しています。これらの濃縮リン酸化ペプチドは、前立腺がんの進行に関与する細胞シグナル伝達経路を理解するためのタンパク質特性評価などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

Protocol

1. pYペプチドの二酸化チタン濃縮

1. 乾燥したダウンリン酸化ペプチドを50% ACN、0.1% TFAの200 μLに再懸濁します。ボルテックスし、10,000 x gで30秒間遠心分離します。これを1回繰り返して、それらをしっかりと再懸濁します。
2. 200 μLのサンプルを収容できるチップに含まれるTiO₂ビーズの調製。
   1. 先端の小さな先端側を軽くたたいて、材料をその端に移動します。100% ACNを200 μL加えてチップをすすぎ、チップを反転させて小さい方の端をフリックして液体をキャップに向かって移動させます。
   2. かみそりの刃を使用して、先端の小さい方の端を切り取り、タンパク質結合性の低いチューブの上に置きます。(ポリスチレンチューブは、TiO₂がチューブの側面にくっつくため、使用しないでください。キャップを外し、マイクロピペットを挿入して、残りのACNを突っ込みます。100% ACNの200 μLで洗浄を繰り返します。TiO₂ビーズは、次のステップのために低タンパク質結合チューブに配置されます。
   3. TiO₂を500 μLの100% ACN 2xで調製し、ピペットでビーズを溶媒と混合します。それらを100 x gで1分間遠心分離します。
   4. TiO₂を500 μLの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH ~7)で2回、ビーズを300 μLの平衡緩衝液で3回洗浄します。TiO₂は非常に密度が高いため、ビーズはすぐに沈殿します。
3. 400 μL の 50% ACN、0.1% TFA を低タンパク質結合チューブに添加し、続いて 84 μL の乳酸を添加します。再懸濁したリン酸化ペプチドを低タンパク質結合チューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターを使用して室温で1時間インキュベートします。
4. ビーズを100 x gで1分間遠心分離し、ペレット化します。300 μLの平衡化バッファー(表1)で2回洗浄し、100 x gで1分間スピンダウンします。
5. ビーズを300 μLのリンスバッファーで2倍洗い、0.2 μmスピンフィルターに移します。1,500 x gで1分間回転させます。
6. フィルターユニットを清潔な1.5mLの低タンパク質結合チューブに移します。H₂O溶液の0.9% NH₃ 200 μLで内容物を2回溶出し、10〜11のpHストリップでpHを測定します。溶出液を真空濃縮して一晩乾燥させ、アンモニアを蒸発させます。

表1:バッファーと溶液。この表は、このプロトコルで使用されるバッファーと溶液の組成を示しています。

ナトリウム

バッファ	容積	組成
6 M 塩化グアニジン溶解バッファー	50ミリリットル	6 M塩化グアニジン、100 mMトリスpH 8.5、10 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、40 mMクロロアセトアミド、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、500 mg n-オクチルグリコシド、超純水(容量)
100 mM ピロリン酸ナトリウム	50ミリリットル	2.23 gピロリン酸ナトリウム十水和物、超純水(容量)
1M β-グリセロリン酸	50ミリリットル	15.31 g β-グリセロリン酸、超純水(容量)
5% トリフルオロ酢酸	20ミリリットル	100%トリフルオロ酢酸1mLを19mLの超純水に加えます
0.1%トリフルオロ酢酸	250ミリリットル	5 mL の 5% トリフルオロ酢酸を 245 mL の超純水に加えます
pY溶出バッファー	250ミリリットル	0.1% トリフルオロ酢酸、40% アセトニトリル、超純水容量
pST溶出バッファー	250ミリリットル	0.1% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリル、超純水容量
IP バインディング バッファー	200ミリリットル	50 mM トリス pH 7.4、50 mM 塩化ナトリウム、超純水
25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 7.5	10ミリリットル	19.7 mg を 10 mL の滅菌超純水に溶解し、pH を 7.5 に 1 N 塩酸 (~10-15 μL/10 ml 溶液) で溶解し、新鮮にします
1M リン酸バッファー、pH 7	1,000ミリリットル	423 mL 1 M リン酸二水素ナトリウム、577 mL 1 M リン酸水素
平衡化バッファー	14ミリリットル	アセトニトリル 6.3 mL、5% トリフルオロ酢酸 280 μL、乳酸 1740 μL、超純水 5.68 mL
リンスバッファー	20ミリリットル	アセトニトリル 9 mL、5% トリフルオロ酢酸 400 μL、超純水 10.6 mL
質量分析ソリューション	10ミリリットル	アセトニトリル 500 μL、5% トリフルオロ酢酸 200 μL、超純水 9.3 mL
バッファ A	250ミリリットル	5 mMリン酸一カリウム(pH 2.65)、30%アセトニトリル、5 mM塩化カリウム、超純水(容量)
バッファB	250ミリリットル	5 mM リン酸一カリウム (pH 2.65)、 30% アセトニトリル、 350 mM 塩化カリウム、 超純水 (容量内)
0.9%水酸化アンモニウム	10ミリリットル	29.42% 水酸化アンモニウム 300 μL 超純水 9.7 mL

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
バキュームマニホールド	レステック	26080
凍結乾燥機	ラブコンコ	7420020
CentriVap卓上型真空濃縮器	ラブコンコ	7810010
エンドオーバーエンドローテーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	415110質問
カミソリの刃	フィッシャーサイエンティフィック	620177
Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット	ミリポアシグマ	UFC901024
Nunc 15 mL コニカルチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-565-268
ミリポア0.2μmスピンフィルター	ミリポアシグマ	UFC30GVNB
低タンパク質結合性エッペンドルフチューブ	エッペンドルフ	22431081
抗ホスホチロシン、アガロース、クローン:4G10	ミリポアシグマ	16101
ペプチドアッセイキット	サーモサイエンティフィック	23275
トリフルオロ酢酸(TFA)	フィッシャーサイエンティフィック	PI-28904
アセトニトリル(ACN)	フィッシャーサイエンティフィック	A21-1
乳酸	シグマ・アルドリッチ	69785から250ミリリットル
水酸化アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A669S-500
リン酸カリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	BP362-500
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-500
塩化カルシウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	BP510-500
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-5
モノチップ	ポリLC株式会社	TT200TIO 96月