二酸化チタンによるリン酸化ペプチドの濃縮:ペプチドライブラリーからのリン酸化ペプチドの選択的単離法

1. pYペプチドの二酸化チタン濃縮

1. 乾燥したダウンリン酸化ペプチドを50% ACN、0.1% TFAの200 μLに再懸濁します。ボルテックスし、10,000 x gで30秒間遠心分離します。これを1回繰り返して、それらをしっかりと再懸濁します。
2. 200 μLのサンプルを収容できるチップに含まれるTiO₂ビーズの調製。
   1. 先端の小さな先端側を軽くたたいて、材料をその端に移動します。100% ACNを200 μL加えてチップをすすぎ、チップを反転させて小さい方の端をフリックして液体をキャップに向かって移動させます。
   2. かみそりの刃を使用して、先端の小さい方の端を切り取り、タンパク質結合性の低いチューブの上に置きます。(ポリスチレンチューブは、TiO₂がチューブの側面にくっつくため、使用しないでください。キャップを外し、マイクロピペットを挿入して、残りのACNを突っ込みます。100% ACNの200 μLで洗浄を繰り返します。TiO₂ビーズは、次のステップのために低タンパク質結合チューブに配置されます。
   3. TiO₂を500 μLの100% ACN 2xで調製し、ピペットでビーズを溶媒と混合します。それらを100 x gで1分間遠心分離します。
   4. TiO₂を500 μLの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH ~7)で2回、ビーズを300 μLの平衡緩衝液で3回洗浄します。TiO₂は非常に密度が高いため、ビーズはすぐに沈殿します。
3. 400 μL の 50% ACN、0.1% TFA を低タンパク質結合チューブに添加し、続いて 84 μL の乳酸を添加します。再懸濁したリン酸化ペプチドを低タンパク質結合チューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターを使用して室温で1時間インキュベートします。
4. ビーズを100 x gで1分間遠心分離し、ペレット化します。300 μLの平衡化バッファー(表1)で2回洗浄し、100 x gで1分間スピンダウンします。
5. ビーズを300 μLのリンスバッファーで2倍洗い、0.2 μmスピンフィルターに移します。1,500 x gで1分間回転させます。
6. フィルターユニットを清潔な1.5mLの低タンパク質結合チューブに移します。H₂O溶液の0.9% NH₃ 200 μLで内容物を2回溶出し、10〜11のpHストリップでpHを測定します。溶出液を真空濃縮して一晩乾燥させ、アンモニアを蒸発させます。

表1:バッファーと溶液。この表は、このプロトコルで使用されるバッファーと溶液の組成を示しています。