遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

Abstract

出典:Riedel, M. et al.遺伝子改変のためのマウス前立腺へのCRISPRガイドのウイルス送達。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、アデノウイルスベースの送達システムを使用して前立腺細胞の特定の遺伝子を編集する方法を説明しています。このアプローチにより、CRISPR技術を利用して遺伝子発現の同所性および局所的な変化が可能になり、前立腺がんの新規マウスモデルを開発できます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス前立腺へのウイルス送達

1. 滅菌済みの1mL注射器と27G x 1/2インチの針による腹腔内注射により動物に麻酔をかけます。麻酔用量は 0.01 mL/g 体重です。手順が30分以上続く場合は、開始用量の1/3を30分ごとに注射して麻酔を維持します。
2. 筋肉の弛緩、ペダルの離脱、眼瞼反射を評価して、麻酔の深さを調べます。反射神経の喪失が観察された場合は、動物の下腹部を剃ります。
3. 角膜反射の欠如による失明を防ぐために、滅菌綿棒を使用して動物の目を獣医用眼科軟膏で慎重に覆います。
4. 剃毛した腹部を70%エタノールと10%ポビドンヨードで拭き取り、手術部位を消毒します。手術領域の中心から周辺に向かって手術領域をこすります。
5. 滅菌手術用ハサミを使用して、約1cmの低腹部正中線で垂直の皮膚切開を行います。
6. 細い先端の鉗子を使用して腹膜を持ち上げ、下に横たわっている臓器の損傷を防ぎます。腹膜を通して手術用ハサミを使用して<8mmの切開を慎重に行います.
   注:人間とは対照的に、げっ歯類の前立腺は4つの別々の葉で構成されています。前葉は精嚢に付着しています。
7. 脂肪組織を静かに脇に動かして、精嚢を露出させます。リング鉗子を使用して、前立腺が特定されるまで精嚢を慎重に持ち上げます(図1)。
8. 30G x 8 mm の針が付いた 0.5 mL インスリン注射器を使用して、前立腺上皮に総量 30 μL のウイルス (3 x 10¹⁰ ウイルス粒子) 溶液を注入します。漏れを最小限に抑え、液体が組織内に吸収され、小さな気泡を形成するようにします。精嚢を腹腔に戻します。
9. 13 mm、3/8 円、および先細りのポイント針を備えた 6-0 吸収性縫合糸を使用して、2-3 の単純な中断縫合糸で腹膜を縫合します。
10. 腹膜の損傷を避けるために、鉗子で皮膚を持ち上げる3つの滅菌4.8 x 6.5 mmクリップで皮膚をホチキス止めします。
11. 回復を良くするには、滅菌済みの1 mLシリンジと27G x 1/2インチの針を使用した腹腔内注射により、麻酔解毒剤を0.01 mL / g体重の用量で適用します。.動物を慎重にケージに戻します。

Results

図 1: 手順の図。この手順は、Plattらによって生成されたRosa26-LSL-Cas9-EGFPマウスで実行されます。前立腺 (AP) は精嚢 (SV) に付着しています。ガイドRNAとCreタンパク質を発現するウイルス粒子を前立腺に注入して、遺伝子発現を変化させます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /Jマウス	ジャクソン研究所	26175
0,5 ml U-100インスリン注射器	BDの	324825	ウイルス注射用
1mlシリンジ	BDの	300013	麻酔注射用
30 G 1/2 ''針	BDの	304000	麻酔注射用
6-0 ポリソルブ縫合糸	メドトロニック	GL889	腹膜を閉じるには
使い捨て滅菌手術用ドレープ	複数のサプライヤー
ヒーティングパッド	複数のサプライヤー
ポビドン-ヨウ素調製パッド	フィッシャーサイエンティフィック	06-669-70
トリミングマシン	エイスクラップ	GT415	腹部を剃る
デュモン鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11252から00
Halseyマイクロニードルホルダー	F.S.T(エフエスティー)	12500-12
アイリスハサミ	F.S.T(エフエスティー)	14094-11
ナローパターン鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11002から12
リング鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11106から09
巻き取りクリップシステムハンドル incl. クリップ	F.S.T(エフエスティー)	12030年01月	スキンを閉じるには
創傷クリップシステムリムーバー	F.S.T(エフエスティー)	12030年04月
1x PBSの	ギブコ	〒10010-023
アンチセダン			動物施設から入手
ブトルファノール			動物施設から入手
メデトミジン塩酸			動物施設から入手
ミダゾラム			動物施設から入手
100%エタノール	フィッシャーサイエンティフィック	22-032-103
目の軟膏	武田薬品	7242
ウイルス(AAV、AV)	複数のサプライヤー		このプロトコルで使用されるウイルスは、社内で製造されています