ゲノムDNAのバイサルファイト変換:消化器癌組織からのゲノムDNAサンプル中のDNAメチル化を研究する方法

要約

出典:Bonetto, A. et al.癌性悪液質の研究のためのモデルとしての結腸-26癌腫瘍担持マウス。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、胃腸がんサンプルからのゲノムDNAのバイサルファイト修飾の手順を示しています。この技術は、遺伝子のメチル化パターン間の関係を調査し、遺伝子の発がん性への寄与を確立するのに有益です。

プロトコル

1. 亜硫酸水素塩処理

1. サンプルとして消化した組織溶液45μLを使用してください。
2. バイサルファイト処理は、製造元の指示に従って、バイサルファイト変換キットの試薬を使用して行ってください(材料表を参照)。
   1. 5 μL の希釈バッファーを DNA サンプルに加え、37 °C で 15 分間インキュベートします(材料表を参照)。
   2. サンプルをインキュベートしている間に、750 μL の dH₂O と 210 μL の希釈バッファーを 1 本のチューブ CT 変換試薬に加えて、バイサルファイト変換試薬を調製します (材料の表を参照)。チューブをボルテックスで10分間混合します。
   3. 15分間のインキュベーション後、調製したCT変換試薬100μLを各サンプルに加え、反転して混合します。
   4. サンプルを50°Cの暗所で12〜16時間インキュベー
   トします。
   5. インキュベーション後、サンプルを取り出し、氷上に10分間置きます。
   6. 400 μLの結合バッファーを添加し、ピペッティングで上下に各サンプルを混合します(材料の表を参照)。各サンプルをスピンカラムにロードし、カラムを2 mLのコレクションチューブに入れます(材料の表を参照)。
   7. 各サンプルを全速力(10,000 x g)で1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
   8. 各カラムに200 μLの洗浄バッファーを添加し、1分間全速力で遠心して、フロースルーを廃棄します(材料の表を参照)。
   9. 各カラムに200 μLの脱スルホン化バッファーを加え、カラムを室温で15分間静置します(材料の表を参照)。インキュベーション後、カラムを全速力で1分間回転させ、フロースルーを廃棄します。
   10. 各カラムに200 μLの洗浄バッファーを加え、全速力で1分間遠心します(材料の表を参照)。
   11. この手順をもう一度繰り返します。
   12. 各カラムに 46 μL の dH₂O を添加し、新しい滅菌 1.5 mL のシングルユースポリプロピレンチューブに各カラムを入れます(材料の表を参照)。各チューブを2分間回転させてDNAを溶出します。
3. 使い捨てポリプロピレンチューブから各スピンカラムを取り外し、廃棄します(材料の表を参照)。これで、DNAを解析する準備が整いました。

2. 定量的メチル化特異的PCR(qMSP)

1. ステップ 1.3 で得られたバイサルファイト修飾 DNA を qMSP での蛍光ベースリアルタイム PCR のテンプレートとして使用し、各遺伝子解析におけるプロモーター領域のメチル化を評価します。
2. 96ウェルリアルタイムPCR装置を使用してqMSPを実行します(材料表を参照)。
   1. 200 nM フォワードプライマー、200 nM リバースプライマー、および 80 nM プローブを使用して、バイサルファイト修飾 DNA 上の標的遺伝子のプロモーターメチル化状態を確認します。16.6 mM(NH₄)₂SO₄、67 mM Tris pH 8.8、10 mM β-メルカプトエタノール、10 nMフルオレセイン、各デオキシヌクレオチド三リン酸0.166 mM、および0.04 U/μlのDNAポリメラーゼを含むマスターミックスを調製します(材料の表を参照)。すべてのアッセイで各ウェルの最終反応量は25 μLです。
   2. qMSPのサイクルは、95°Cで5分間、続いて95°Cで15秒間、60°Cで1分間、72°Cで1分間のサイクルを55回行います。
      注:標的遺伝子は、ベータ値が大きいこと、プロモーター領域のCpGアイランドに関連していること、およびqMSPのプライマーおよびプローブ設計に適しているという基準に基づいて選択する必要があります。
3. CpGメチラーゼ(M.SssI)で処理したヒトゲノムを陽性メチル化制御として使用します(材料表を参照)
   手記：メチル化の最終的な定量は、相対メチル化値(RMV)として定義され、β-アクチン(ACTB)の平均Ctと比較して、各メチル化検出の反復ごとに2^–ΔΔCtとして計算されます。プライマーとプローブの配列を表1に示します。検出されない反復には Ct 100 が使用され、2 ^{- ΔΔCt} の値はゼロに近くなります。次の式が使用されます:
   平均 2^–ΔΔCt (RMV) = (2^–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.

遺伝子	フォワード 5' - 3'	リバース 5' - 3'	プローブ
B-アクチン	タグ: GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT	AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC	\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG ギャグ ギャグ GTT タグ \3IABkFQ\
EPB41L3	GGG ATA GTG GGG TTG ACG C	ATA、AA、ATC、CCG、ACG、AAC、GA	AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(NH4)2SO4	シグマ・アルドリッチ	14148
10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	351-032-721 EA
100%エタノール	シグマ・アルドリッチ	24194
ABI StepOnePlusリアルタイムPCRシステム	アプライドバイオシステムズ	4376600	96ウェルリアルタイムPCR装置
CT変換試薬	ザイモリサーチ	D5001-1
デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)	インビトゲン	10297-018
DEPC処理水	DEPC処理水	〒351-068-131
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	コーニング	46-034-CL
EZ DNAメチル化キット	ザイモリサーチ	D5002
ヒトゲノムDNA	ニューイングランドバイオラボ	N4002Sの
Infinium Human Methylation 450 アッセイ	イルミナ	WG-314	ゲノム中の>450,000 CpG部位のメチル化状態を評価するためのDNAメチル化の複雑な評価のためのアレイプラットフォーム
ライトサイクラー480	ロシュ	5015278001
M-結合バッファー	ザイモリサーチ	D5002-3
M-脱スルホン緩衝液	ザイモリサーチ	D5002-5
M-希釈バッファー	ザイモリサーチ	D5002-2
M-Washバッファー	ザイモリサーチ	D5002-4
プロテイナーゼK	ニューイングランドバイオラボ	P8107S型
使い捨てポリプロピレン(Eppendorf)チューブ	エッペンドルフ	24533495
トリス塩酸塩(トリス-HCL)2 M pH 8.8	品質、生物学的	〒351-092-101
Zymo Spin 1カラム	ザイモリサーチ	C1003
β-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M3148
フルオレセイン	バイオ・ラッド	#1708780
Platinum Taqポリメラーゼ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10966-034