ガラス固化法による凍結保存:生物試料を超低温で長期保存するための超急速冷却技術

要約

出典:Lu, J. H. et al.胃がん患者由来異種移植モデルおよび初代細胞株の確立。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、生体試料を保存するための超高速クライオガラス化法を実演します。この方法では、細胞内の氷の結晶形成を防ぐことにより、生体組織を凍結損傷から保護するために、凍結保護剤の組み合わせを使用することを伴います。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 組織凍結保存

>注:この部分は主にLive Tissue Kitクライオキットの方法を参照しています。主なキットと機器は、材料の表に記載されています。

1. 腫瘍の直径が10mmを超える場合は、IRBが承認した方法でマウスを安楽死させます。
2. 滅菌鉗子とはさみを使用して、マウスから腫瘍をゆっくりと分離します。
3. 10cmの皿で腫瘍組織をDPBSで洗います。壊死領域、脂肪組織、血栓、結合組織を鉗子やハサミで解剖し、除去します。
4. 腫瘍組織を型で最大1mmの厚さに切断します。
5. 10cmの皿でDPBSでスライスを洗います.
   手記：ガラス化プロセスでは、ステップ1.6〜1.8でV1 / V2 / V3とラベル付けされたチューブを使用します。主な成分はDMSOとスクロースです。
6. スライスを鉗子でチューブV1に移し、チューブを4°Cで4分間インキュベートします。
7. V1溶液を注ぎ、スライスして10cmの皿に入れます。スライスを鉗子でチューブV2に移し、チューブV2を4°Cで4分間インキュベートします。チューブを短時間転がして反転させ、さらに4°Cで4分間置きます。
8. V2溶液を注ぎ、スライスして10cmの皿に入れます。スライスを鉗子でチューブV3に移し、チューブを4°Cで5分間インキュベートします。チューブを短時間転がして反転させ、4°Cで少なくとも5分間置きます。スライスがすべてチューブの底に沈むことを確認してください。
   1. いくつかのスライスが浮いたままの場合は、チューブを短時間転がして反転させ、すべてのスライスが完全に沈むまでチューブを再び4°Cに置きます。必要に応じて、フローティングスライスを廃棄します。
9. V3溶液を注ぎ、スライスして10cmの皿に入れます。
10. ティッシュホルダーを適切な長さにカットし、滅菌ガーゼの上に置きます。スライスをホルダーに移します。ホルダーをガーゼで包み、鉗子を使用して液体窒素に入れ、続いて5分間インキュベートします。
11. 極低温バイアルに組織情報をラベル付けします。
12. ティッシュスライスを載せたホルダーを極低温バイアルに移し、液体窒素で保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ライブティッシュキット Cryo Kit	Celliver Biotechnology、上海、中国	LT2601
ティッシュ加工された金型と補助ブレード	Celliver Biotechnology、上海、中国	LT2603
DPBSの	Basalmedia Technology、上海、中国	L40601