腹膜低密度好中球単離:磁気活性化細胞選別法による腹膜洗浄液からの低密度好中球取得技術

要約

出典:Kanamaru, R. et al.腹膜洗浄液から得られる低密度好中球によって生成される好中球細胞外トラップは、腫瘍細胞の成長と付着を媒介します。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、術後のヒト患者の腹膜洗浄液から低密度好中球(LDN)を分離する手順を説明します。このようにして得られたLDNは、腫瘍の成長と進行におけるLDNの役割を理解するために、さらなる下流実験で使用することができます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

>1. 腹腔洗浄液からのLDNの分離

1. サンプル取得
   1. 胃腸悪性腫瘍のために腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖前に、1,000mLの正常な滅菌生理食塩水を直接腹腔内に注入します
      手記：サンプルは、胃切除術、結腸切除術、または食道切除術を受けた患者から、年齢や性別に基づく偏りなく採取されました。生理食塩水を容器に移し、1分以内に腹部全体に注ぎました。これは、患者に大きな影響を与えることなく、術後の腹膜洗浄として日常的に行われます。
   2. 腹腔内を少なくとも1分間広範囲に洗浄します.
      手記：注入された液体は、サンプルが均一になるように、外科医の手でゆっくりと攪拌することをお勧めします。
   3. 4つの50 mLシリンジで200 mLの洗浄液を回収します><。 手記：場合によっては、ゴム製のコネクタを使用して液体を取り込むことがあります。
2. 顆粒球特異的mAb、CD66b
   を用いた腹膜LDNの精製 手記：密度勾配遠心分離後の中間層には多くの単核細胞が含まれているため、CD66b mAbを用いた多形好中球の正選択を行った。
   1. 腹膜洗浄液を50mLチューブに移します.
      手記：このステップでは、液体を100μmのナイロンフィルターに通して不純物を取り除きます。
   2. 腹膜液を270 x gで室温で7分間遠心分離します。
   3. ペレットを0.02% EDTAを含む5 mLのPBSに再懸濁します。
   4. 5 mLの細胞懸濁液を3 mLの密度勾配溶液に慎重に重ね合わせます。
   5. 1,700 x gで15分間、室温で休憩なしで遠心分離します。
   6. 中間層を含む溶液(図1A)をピペットで約2〜3mL回収し、0.02%EDTAを含むPBS10mLと混合します。
   7. 腹液を400 x gで7分間RTで遠心分離し、上清を捨てます。
   8. 0.02% EDTAを含むPBSをさらに10 mL加え、室温で270 x gで7分間遠心分離します。
   9. 細胞ペレット(1 x 10⁷)を磁気細胞分離キット用の60 μLのバッファーに溶解します。
   10. 20 μLのFcブロックをペレットに加え、4°Cで10分間インキュベー
   トします。
   11. マイクロビーズで標識した抗CD66bを20 μL加え、4°Cでさらに10分間インキュベー
   トします。
   12. ペレットを洗浄し、500 μLのMACSバッファーに再懸濁します。
   13. 細胞懸濁液を適切な磁気セパレーターの磁場中の磁気カラムに適用し、カラムを15mLのバッファーで洗浄することにより、CD66b(-)細胞を含むフロースルーを回収します。
   14. カラムを磁気セパレーターから取り外し、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、磁気標識されたCD66b(+)細胞をすぐに洗い流します
       手記：CD66b(+)細胞集団は、FACS分析によって決定されるように、主に好中球で構成されており、CD66(+)画分の>95%がCD11b、CD15、およびCD16に対して陽性であるが、CD14に対して陰性であることを示しています。

結果

図1:腹膜LDNの培養後のNET形成。(ア)(B)次に、CD66b(+)LDNをCD66b(-)単核細胞から分離し、ポリ-L-リジンでコーティングした6ウェルプレート上で培養した後、核染色色素を添加し、蛍光顕微鏡で直ちに観察した。(D)LDN単層をDNase Iと5分間インキュベートした後、核染色を行った。(E)CD66b(+)LDNをプラスチックプレート上でコーティングせずに培養した。白いバーは 100 μm を表します。この数値は、以前の出版物から変更されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア、スウェーデン	17-1440-02
ストレートフロム™全血CD66bマイクロビーズ	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	130-104-913
FCブロック	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-059-901
MACSリンスソリューション	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-091-222
0.5mol/l-EDTA溶液(pH8.0)	ナカライテスク、日本	06894から14
MACS BSAストックソリューション	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-091-376
LSカラム	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-041-306
MACSマグネティックセパレーター	Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ	〒130-042-501