方法論記事

好中球細胞外トラップまたはNETの蛍光顕微鏡法:がん細胞とNETとの間の接着相互作用を観察する技術

2023年4月30日

この記事について

要約

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出典:Kanamaru, R. et al.腹洗浄液から得られる低密度好中球によって生成される好中球細胞外トラップは、腫瘍細胞の成長と付着を媒介します。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、好中球によって排出される細胞外DNA成分である好中球細胞外トラップ(NET)の蛍光染色を示しています。この技術により、がん細胞とNETsとの接着相互作用を可視化することができます。

プロトコル

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1. 赤色蛍光細胞リンカー色素による腫瘍細胞の染色

  1. ヒトがん細胞株MKN45、NUGC、およびOCUM-1を調製します。
  2. 15 mLチューブで1 x 107細胞をPBS + 0.02% EDTAで洗浄し、270 x gで室温で7分間遠心分離します。
  3. 色素染色用溶液1mLをペレットに加え、静かにピペットで動かします。
  4. 4 μL の Red Fluorescent Cell Linker 色素を 1 mL の溶液に溶解して染色し、ステップ 1.2 の細胞懸濁液と混合します。
  5. ペレットを室温で4分間インキュベートします。
  6. 4 mLのDMEM(10% FBS)を加えて染色反応を停止します。
  7. 270 x gを7分間遠心分離し、上清を捨てます。
  8. 手順 1.6 と 1.7 を 2 回繰り返します。
  9. 蛍光顕微鏡(励起=551nm、発光=567nm)で腫瘍細胞が赤く染色されているか確認します。

2. 腫瘍細胞のNETsへの接着性の解析

  1. 低密度好中球細胞を6ウェルポリ-L-リジンコーティングプレート(直径6cm)で37°C、5%CO2で2時間培養すると、好中球細胞外トラップまたはNETの産生が可能になります
  2. 赤色蛍光染色腫瘍細胞(1 x 106)を、0.1% BSAを添加したRPMI 1640 1 mLに移します。
  3. NETを産生したLDN培養物に腫瘍細胞を添加します。
  4. 37°Cで5分間インキュベートすると、腫瘍細胞がNETs.
    に接触できるようになります。 手記：長時間のインキュベーションは、腫瘍細胞のLDNまたはプレートへの接着を誘導します。
  5. 培地を取り出し、予熱した培地2mL(0.1%BSA + RPMI 1640)を加えて皿を回してウェルをやさしく洗います。
  6. 手順2.5の洗浄手順を2回繰り返します.
    手記：NETはプレートに付着しにくいため、NET自体が剥がれないように、できるだけ優しく洗濯する必要があります。
  7. NETを可視化するために、核と染色体を最終濃度5 μg/mLで染色するための緑色蛍光色素を添加します。
  8. 適切なフィルター(緑、励起= 504 nm、発光= 523 nm、赤、励起= 551 nm、放出= 567 nm)を使用して、NETおよび付着腫瘍細胞を観察します。
  9. 数値をマージして、NETs.
    手記：一部の実験では、5分間の共インキュベートの5分前に、DNA分解酵素をLDN培養物(最終濃度100 U/mL)に添加しました。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SYTOXグリーン核酸染色剤5 mM溶液DMSO溶液 サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国 S7020
PKH26 一般細胞膜標識用赤色蛍光細胞リンカーキット Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイスP9691
RPMI1640ミディアSigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイスR8758
ウシ血清アルブミン凍結乾燥粉末、≥96%(アガロースゲル電気泳動) Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイスA2153の
ポリ-L-リジンコーティングマイクロプレート 6Well IWAKI, 日本 〒4810-040
フルオレセイン実体顕微鏡 BX8000、キーエンス、大阪 BZ-X710
MKN45ヒト胃がん細胞株 理化学研究所, 筑波島 該当なし
NUGC-4ヒト胃癌細胞株 理化学研究所, 筑波島 該当なし
OCUM-1ヒト胃癌細胞株 大阪市立大学 該当なし Dr. M. Yashiroからの贈り物
DNase I ニュージャージー州レイクウッドのワージントンLS002138
0.5 mol/l-EDTA溶液(pH 8.0) ナカライテスク、日本 06894から14
ダルベッコ修正イーグル中高血糖(DMEM) Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイスD5796
シリーズ ) 型 ム ) ) )

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タグ

NET L RPMI 1640

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