好中球細胞外トラップまたはNETの経時蛍光顕微鏡法:がん細胞とNETとの間の接着後相互作用を分析する技術

要約

出典:Kanamaru, R. et al.腹膜洗浄液から得られる低密度好中球によって生成される好中球細胞外トラップは、腫瘍細胞の成長と付着を媒介します。J. Vis. Exp.(2018年)

この動画では、低密度の好中球と胃がん細胞を共培養することで、好中球細胞外トラップ(NET)に閉じ込められたがん細胞の接着後の挙動を解析しています。タイムラプスビデオ解析は、さまざまな細胞イベントを監視し、病的状態におけるNETの役割を研究するのに役立ちます。

プロトコル

1. 捕捉された腫瘍細胞のタイムラプス映像解析

1. ポリ-L-リジンでコーティングした35 mmの丸型皿で腹膜LDNを培養し、5% CO₂で37°Cで2時間インキュベー
トします。
2. 核と染色体を染色するための緑色蛍光色素を添加して、最終濃度5 μMのNETを視覚化します。
3. 1分間のインキュベーション後、培地を取り出し、0.1% BSA + RPMI 1640を2 mL加えます。
4. 培地を取り出し、0.1% BSA + RPMI 1640に懸濁した未染色の1 x 10⁶ MKN45細胞を加えます。RTで5分間インキュベートします。
予
5. 熱した培地2mL(0.1%BSA + RPMI 1640)を加えて皿を優しく洗い、皿を回転させて、付着していない腫瘍細胞を取り除きます。
6. 上記の洗浄手順を2回繰り返します.
   手記：NETはプレートに付着しにくいため、NET自体が剥がれないように、できるだけ優しく洗濯する必要があります。
7. 100 u/mL ペニシリンと 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した 10% FCS を含む DMEM を添加します。
8. 培養皿を全景の細胞観察システムに取り付け、腫瘍細胞がNETによってトラップされる適切なフィールドを選択します。
9. さらに2日間共培養を続け、通常の光と蛍光で6分ごとにフィールドの連続写真を撮り、それぞれMKN45細胞とNETを検出します。
10. 各時点で画像を重ね合わせ、Image Viewerソフトウェアを使用してタイムラプスビデオを構築します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SYTOXグリーン核酸染色剤5mM溶液DMSO溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	S7020
RPMI1640ミディア	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス	R8758
ダルベッコ修正イーグル中高血糖(DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス	D5796
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス	D8537
ウシ胎児血清、認定、USDA承認地域	gibco by life technologies、メキシコ	〒10437-028
ウシ血清アルブミン凍結乾燥粉末、≥96%(アガロースゲル電気泳動)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス	A2153の
ペニシリンストレプトマイシン	ライフテクノロジーズジャパン	15140-122
プラズモシン予防	InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ-米国	アント-MPP
フルオレセイン実体顕微鏡	BX8000、キーエンス、大阪	BZ-X710
全景細胞観察システム	ニコン、神奈川県、日本	バイオスタジオ(BS-M10)
MKN45ヒト胃がん細胞株	理化学研究所, 筑波島	該当なし

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