エキソソームブロック調製:培養ヒト結腸癌細胞からのエクソソームを保存するためのプロトコール

要約

出典:Jung, M. K. et al.透過型電子顕微鏡によるエクソソームのサンプル調製とイメージング。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、培養した消化管腫瘍細胞からエキソソームブロックを調製する技術について説明しています。これらのエキソソームブロックをさらにスライス、染色、およびイメージングして、脂質二重層小胞内の特定のタンパク質の位置を決定することができます。

プロトコル

1. エクソソームのブロック調製

1. HCT116細胞の培養上清からエキソソームを100,000 x gで1.5時間遠心分離してペレット化し、培養上清を除去し、精製したエキソソームペレットを2.5%グルタルアルデヒド1 mLの2.5%グルタルアルデヒドで0.1 Mカコジル酸ナトリウム溶液(pH 7.0)に4°Cで1時間1時間慎重に固定します。0.1 Mカコジル酸ナトリウムの場合、 4.28 gのカコジル酸を160 mLの蒸留水(DW)に溶解します。0.1 M HClでpHを7.4に調整し、蒸留水で最大200 mLにします。
2. 固定液を取り出し、ペレットを0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液1 mLで室温ですすいでください。3回繰り返し、各変更が10分間続きます。
3. サンプルを 1 mL の 2% 四酸化オスミウムで 4 °C で 1 時間後固置します。
4. 固定液を取り出し、0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーで10分ごとに3回すすぎます。
5. 傾斜したアセトンシリーズ(それぞれ50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)をシェーカーに載せて10分間インキュベートします。
6. アセトンを除去し、3:1アセトン:低粘度包埋混合物の溶液を30分間インキュベートします。エキソソームペレットはチューブ内にあります。
7. 培地を取り出し、1:1のアセトン:低粘度包埋混合物培地を加え、30分間インキュベートします。
8. 培地を取り出し、1:3アセトン:低粘度包埋混合物培地を加え、30分間インキュベートします。
9. 培地を取り出し、100%低粘度の包埋混合物を加え、室温で一晩インキュベートします。
10. 包埋型を使用してサンプルを純粋な低粘度包埋混合物に埋め込み、65°Cで24時間ベークします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グルタルアルデヒド	EMSの	16200
カコジル酸ナトリウム	EMSの	12300
四酸化オスミウム1g結晶	EMSの	19100	ヒュームフードでのみ使用
アセトン	純生	1B2031

年