エキソソーム切片の金免疫染色:エキソソーム内腔の診断マーカーを可視化する技術

要約

出典: Jung, M. K., Mun, J. Y. 透過型電子顕微鏡によるエクソソームの試料調製とイメージング. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、極薄エクソソーム切片の内腔領域に局在するバイオマーカーの金免疫染色を実演しています。この技術により、罹患細胞が分泌するエクソソーム内の標的分子を可視化することで、疾患の早期診断が可能になります。

プロトコル

1. エクソソーム切片の免疫染色とイメージング

1. エクソソームブロックの60 nmの極薄切片をウルトラミクロトームで作製し、ニッケルグリッド上に集めます。
2. 0.02 Mグリシンの50 μL滴でグリッドを10分間インキュベートし、遊離アルデヒド基をクエンチします。
3. 100 μLのDWを各3回、10分間すすぎ、1% BSAを含むPBSで室温で1時間インキュベートします。
4. 50-100 μL滴の抗KRS抗体 (0.1% BSAを含むPBSに1:100) でグリッドを1時間インキュベートします (必要に応じて、このステップを4°Cで一晩実施する必要があります)。
5. 0.1% BSAを含むPBSを5滴(50 μL)でグリッドをそれぞれ10分間洗浄します。
6. グリッドを二次抗体の滴下に1時間移します(0.1%BSAを含むPBS中の10 nm金粒子(1:100)に結合した抗ウサギIgG)。
7. 0.1% BSAを含むPBSを10分ごとに5滴(50 μL)でグリッドを洗浄します。
8. 暗所条件下で2%酢酸ウラニルと20分間、レイノルズクエン酸鉛とそれぞれ10分間ダブル染色します。
9. 80 kVの透過型電子顕微鏡でグリッドを観察します。
10. 「Acquire」をクリックし、次に「File」をクリックし、80 kVのTEMの下のCCDカメラシステムで「Save as」をクリックします。露光時間は自動設定に従いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸ウラニル	EMSの	22400	危険な化学物質
クエン酸鉛	EMSの	17900
透過型電子顕微鏡	日立	H7600 (英語版)
銅グリッド	EMSの	G200-CU
グリシン	シグマ	022K5404
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ	P4417
ウシ血清アルブミン	オーリオン	25557
精製された抗ヒトCD274(B7-H1、PD-L1)抗体	バイオレジェンド	329710	インムモゴールド山全体
精製マウスIgG2b、κアイソタイプCtrl	バイオレジェンド	401202	ホールマウントImmumogold(コントロール)
2番目の抗マウスIgG標識9-11 nm金粒子	シグマ	G7652
パラホルムアルデヒド	EMSの	19210