切片化のための筋肉組織のスナップ凍結:急速に凍結したマウスの筋肉組織の極薄切片を得るためのプロトコル

要約

出典: Bonetto, A. et al. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオでは、筋肉組織をスナップで凍結し、その薄い切片を取得する手順を説明しています。この技術は、結腸がんマウスモデルにおけるがん関連悪液質の研究に役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 筋肉の凍結と取り付け

1. イソペンタンを含む小さなプラスチックビーカー(50mL)の下半分を液体窒素に浸します。イソペンタンは、わずかに粘性が増し、ビーカーの内側を覆う固体の白いラミネートを形成するとすぐに使用できます(温度:-160°C).
   手記：常に火花を散らさないブロンズまたはアルミニウムの手工具を使用してください。製品の蒸気を吸い込まないでください。十分な換気をして使用してください。こぼれや換気に対処することが不可能または非現実的の場合は、適切な呼吸器を着用してください。
2. チャック(コルク)に埋め込まれた媒体をイソペンタンに短時間(10秒)浸して凍結します。
3. 筋肉(脛骨筋や腓腹筋など)をコルクに対して垂直に腱で保持して、繊維の向きを維持し、断面を可能にするために、筋肉を処理します。
4. 新鮮な筋肉の端部を冷凍埋め込み培地の上に慎重に配置します.
   手記：筋肉がくっつきます。筋肉を埋め込み媒体で完全に囲まないことが重要です。また、その後の断面積の決定のために、垂直方向を維持することも重要です。
5. 取り付けた筋肉をチャックをイソペンタン浴に浸します(通常の凍結時間は、標本のサイズと組成によって異なりますが、7〜15秒です).
   手記：凍結液への浸漬は、試料を完全に凍結するために必要な時間以上に持続してはいけません。凍結が長すぎると組織ブロックが骨折し、短すぎると氷の結晶が形成されます。よく凍った標本は白亜質になります。
6. 凍結後、小さなビニール袋または試料チューブ(50mL)に入れ、すぐに-80°Cのディープフリーザーまたは液体窒素で保存してください。

2. 筋肉切片

1. クライオスタットの内部チャンバーの作動温度を約-23°Cに設定します。
2. 試験片(以前は-80°Cで保存)を作業温度で順応させます(数時間で十分です)。
3. 標本の厚さ8μmの複数の切片(できれば前脛骨筋または腓腹筋)を切断し、スライドガラスに集めます><。 手記：筋肉の中腹部分の部分をカットします。また、精度を上げるために、取り付け軸に対して垂直にセクションをカットします。
4. スライドガラスはクライオスタットチャンバー内に置いておきます。IF/IHC試験や酵素染色を目的としている場合は、解凍しないでください。
5. スライドは-80°Cで保存し、さらに分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10月	ティッシュテック	4583
クライオスタット	ライカ	CM1850
コルクディスク	電子顕微鏡科学	63305
スーパーフロストとスライドガラス	VWRの	48311-703

名 の