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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 溶液の準備
- 表1に記載されているように、コロンバッファー、シリカベースの密度分離培地100%、シリカベースの密度分離培地66%、シリカベースの密度分離培地44%、コラゲナーゼE消化バッファー、およびFACSバッファーを調製します。
- 手順の前日にコロンバッファーを調製し、4°Cで一晩保存してください。
- 処置の前日に100%シリカベースの密度分離培地を調製し、4°Cで一晩保存し、処置の朝に室温で解凍します。
- 単離の朝に、室温の100%シリカベース密度分離培地とコロンバッファーを使用して、66%および44%シリカベースの分離培地を調製します。
- Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼEの適切な量を測定し、手順の前に-20°Cで一晩保存します。翌朝、適切な量のColon Bufferに溶解して、Collagenase Digestion Bufferを導き出します。手順の日にコラゲナーゼ消化バッファーを使用したすべてのインキュベーションでは、溶液を37°Cに予熱してください。
- プロトコールの全ステップで、1台の遠心分離機を20°C、回転速度859 x gに保ち、ブレーキを非アクティブ(減速0)にしてグラジエント遠心分離を行います。洗浄ステップのために、別のものを4°Cに設定し、回転速度を859 x gに設定し、標準的な減速
で行います。
2. コロンの収穫
- CO2窒息法によりマウスを安楽死させ、その後AALAC承認の確認法で安楽
死させます。
- マウスを仰臥位に置き、毛皮に70%エタノールをスプレーします。大きなティッシュハサミを使用して、垂直の正中線を切開し、無傷の腹膜を露出させます。
- 細かい解剖ハサミを使用して、腹膜を開きます。鉗子を使用して小腸を片側に動かし、下行結腸を露出させます。下行する結腸をわずかに上に引っ張って、結腸の直腸部分を最大限に露出させます。骨盤の奥深くで遠位直腸を切開し、遠位直腸から盲腸キャップまで、結腸全体を1つの単位として解剖して除去します。
- 結腸を20mLの冷やしたColon Bufferに入れ、50mLのポリプロピレンチューブに移します。
3. コロンのクリーニング
- 湿らせたペーパータオルの上に結腸を置き、はさみや鉗子の鈍い端で腸壁に穏やかな圧力を加えて固形便を抽出します。
- 結腸をペトリ皿に入れ、18Gの鈍い充填針を備えた10mLのシリンジを使用して、10mLの冷やした結腸バッファーで腸を洗い流します。
- 結腸をColon Bufferで湿らせたペーパータオルに移し、ハサミの鋭い端で腸間膜と脂肪を取り除きます。
- 5〜10 mLの冷やしたコロンバッファーで満たされたペトリ皿に結腸を置き、手動で攪拌して残りの結腸内容物を洗浄します。2〜3回繰り返します。
- 結腸を、より筋肉質な直腸端から近位結腸まで縦方向に切断します(単一の長方形の開いた結腸片を生成します)新鮮で冷やした結腸バッファーで。既存のメディアを廃棄し、清潔に冷やしたコロンバッファーを補充します。
- 腸をペトリ皿で激しく渦巻かせ、洗うたびに5〜10mLの冷やしたコロンバッファーを交換して、腸を3回洗浄します。
- 長方形の結腸ティッシュを、コロンバッファーで湿らせたペーパータオルの上に置き、水平にスライスしてカットし、次に小さな断片(3 mm x 3 mmセクション)にカットします。
- 細い鉗子を使用して結腸の断片を慎重に収集し、50 mLのポリプロピレン円錐管内の20 mLの冷やした結腸バッファーに入れます。.
- 結腸の断片を3回洗浄し、各洗浄を20mLのコロンバッファーで、チューブを30秒間激しく撹拌しながら洗浄します。各攪拌の間に、組織断片がチューブの底に沈殿するのを待ちます。上清をデカントまたは真空吸引しながら、各洗浄間の吸引プロセスでの組織断片の損失を防ぎます.
手記： 洗濯のたびにチューブを交換する必要はありません。
4. コラゲナーゼ消化1
- 20 mLのコラゲナーゼ消化バッファーを、50 mLのポリプロピレンコニカルチューブ内の洗浄した結腸フラグメントに加えます。
- 閉じた50mLチューブをインキュベートしたオービタルシェーカーに37°Cで置き、回転速度を2 x gに設定して60分間、組織片が動いていることを確認し、必要に応じて、回転速度を段階的に増やして、チューブの底部に組織片が沈殿しないようにします。
>5. シリカベースの分離媒体グラジエントの準備
- 100% シリカベースの密度分離培地を 20 °C(室温)で使用し、66% および 44% シリカベースの密度分離培地とコロンバッファーを調製します。
- 5 mLの66%シリカベースの密度分離培地を3本の別々の15 mLポリプロピレンチューブのそれぞれに注ぎます。結腸ごとに3本のチューブを準備します。これにより、グラジエント分離手順の高密度ベースが形成され、その上に低密度の分離媒体が層状にされて分離グラジエントが作成されます。
- 使用するまで20°Cで保管してください。
6. 消化液からの上澄みの収集 1.
- 25 mLの血清ピペットを使用して上清のみを採取し、コラゲナーゼ消化1が完了したら、清潔な50 mLポリプロピレン円錐管に入れた40 μmの細孔ろ過布セルストレーナーで上清をろ過します。既存の組織片を吸引しないように注意してください.
注:チューブ内に残っている目に見える組織の断片を保持します。これらは 2 回目のコラゲナーゼ消化を受けます (ステップ 8)。
7. クエンチングコラゲナーゼ消化バッファー
- 50 mLのポリプロピレンチューブに冷やしたColon Buffer.
を完全に充填します。
手記： コラゲナーゼは37°Cで活性を示します。したがって、チルドバッファーはこの酵素を不活性化します。
- チューブを4°C、800 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を真空吸引で捨てます。細胞を25 mLの新鮮なColon Bufferで洗浄し、800 x gで5分間遠心分離します。
- ペレットを1 mL未満の新鮮で冷やしたColon Bufferに再懸濁します。
- 50 mLのポリプロピレンコニカルチューブを氷の上に置きます。
8. コラゲナーゼ消化 2
- ステップ4(消化1)を繰り返し、ステップ6.1の残りの組織片を保持します。
9. 消化後の組織分解 2.
- 組織片をチューブと10mLシリンジの間で18Gの鈍い端の針で激しく前後に洗い流します。
- このフラッシュを最低7〜8回の完全な通路で繰り返し、肉眼的な組織の断片や破片が見えなくなるまで続けます。
10. セルをフィルタリングする
- 組織脱凝集懸濁液を40 μmの細孔ろ過布製セルストレーナーに通し、清潔な50 mLポリプロピレンチューブに入れます。
- ろ過布製セルストレーナーを10 mLの冷やしたColon Bufferで洗浄し、フィルターに閉じ込められた細胞を回収します。
11. コラゲナーゼ消化のクエンチ
ング
- 50 mLのポリプロピレン円錐管を冷やしたColon Bufferを縁まで満たします。
注:コロンバッファーの温度は、コラゲナーゼ活性の消光を確実にするために重要です。
- 4°C、800 x gで5分間遠心します。
- 上清を真空吸引で捨てます。
- 25 mLの新鮮な冷やしたColon Bufferに再懸濁して洗浄し、続いて4°C、800 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を真空吸引で捨てます。
- コラゲナーゼ消化1(ステップ7)から再懸濁したペレットを、ステップ11.4の対応するチューブにプールします。
- ステップ11.4(洗浄と遠心分離)を繰り返します。
12. シリカベースの密度分離 媒体 グラジエント分離
>注:コラゲナーゼ活性の迅速な消光を確実にするために、手順12-13をできるだけ早く実行してください。
- ステップ11.7に続いて、各ペレットを結腸あたり合計44%シリカベースの密度分離培地24 mLに再懸濁します。
- ステップ 12.1 で調製した 3 本のチューブ(66% シリカベースの密度分離培地を含む)のそれぞれに、ステップ 12.1 の培地 8 mL を 10 mL の血清ピペットを使用してゆっくりと重ね合わせます。44% 密度分離媒体の安定したゆっくりとした流れを維持しながら、グラジエントを重ねることで、界面の混乱を防ぎます。
- 遠心分離機のバケツ内のすべてのチューブを、体重計または天秤を使用して慎重にバランスを取ります。
- ブレーキなしの遠心分離機で859 x g、20°Cでチューブを20分間回転させ、ローターを完全に休ませてからチューブを取り外す前に、グラジエント界面の細胞を破壊しないように注意します。
13. Gradient Interfaceから単核細胞を収集する
- グラジエント界面(5 mLマーク付近)を視覚化し、通常は厚さ1〜2 mmの白色バンド(MNCを含む)が存在することを確認します。
手記： 白い帯が見える場合と見えない場合があります。ただし、MNC はこのインターフェイスにあり、グラデーション インターフェイスの明瞭さを曇らせる必要があります。
- 上部グラジエントの上部7 mLを真空吸引して廃棄し、ピペットがインターフェースに簡単にアクセスできるようにします。
- 連続的な手動吸引と安定した回転手首の動きを使用して、細胞の界面層をきれいな50mLポリプロピレン円錐管に集めます。2つのグラジエント間の界面が透明で屈折性(細胞がなくなる)になるまで収集します。
- コレクションチューブに冷やした50mLのFACSバッファーを入れます。4°C、800 x gで5分間遠心します。
- 真空吸引により上清を吸引し、ペレットを1mLのFACSバッファーに再懸濁します。
- 血球計算盤で、適切な死細胞排除法を用いて1:2希釈で細胞をカウントします。
- FACS染色または新たに単離された結腸MNCによる他のアッセイに進みます。
表1:溶液調製表
| 解決 | 式 |
| コロンバッファー | 500 mL RPMI + 10 mM HEPES + 10% FBS(56°Cで60分間熱不活化、pHを7.3に調整) |
| シリカベースの密度勾配培地 100% (結腸あたり) | 22.5 mL のシリカベースの密度勾配培地 + 2.5 mL の 10x PBS |
| シリカベースの密度勾配培地 66%(結腸あたり) | 10.72 mL シリカベースの密度勾配培地 100% + 5.28 mL コロンバッファー |
| シリカベースの密度勾配培地 44% (結腸あたり) | 11 mL シリカベースの密度グラジエント培地 100% + 14 mL コロンバッファー |
| コラゲナーゼ消化バッファー(結腸あたり) | Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼE 100 U/mLを40 mL Colon Bufferに溶解 |
| FACSバッファ | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0.2 g アジ化ナトリウム |