出典:Teal, E. et al.再生研究のためのマウスおよびヒト由来の初代胃上皮単層培養。J. Vis. Exp.(2018年)
このビデオでは、ヒトの眼底組織から胃上皮細胞を分離する方法について説明しています。単離された上皮細胞は、胃生理学および病態生理学におけるそれらの調節役割を研究するためのin vitroモデルとして使用できます。
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方法論記事
胃底腺の分離:ヒトの胃組織から眼底腺を分離する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. ヒト由来の3次元胃底オルガノイドの確立
>注:汚染を避けるために、無菌組織培養フード内でプロトコール全体を行ってください。ヒト眼底組織は、スリーブ状胃切除術を受けている患者から採取されました。
- スリーブ状胃切除術を受ける患者から組織を採取し、大きなプラスチック容器に入った氷冷したCa2+/Mg2+フリーのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に入れます。
- 鉗子を使用して、100 mL Ca2+/Mg2+フリーDPBSを含む滅菌ビーカーで組織を激しく洗浄します。約30秒間、または破片と血液が取り除かれるまで洗浄します。次に、滅菌ガーゼを使用して、上皮から粘膜層を拭き取ります。
- 大きな鉗子を使用して、組織の筋肉層をしっかりとつかみ、力を入れて、大きな湾曲した止血鉗子を使用して上皮をこすり落とします。削り取った上皮片を滅菌ポリスチレン製シャーレに集めます。
- 上皮組織をカミソリを使用して約2.0 x 2.0 mm2サイズの断片に細かく刻み、組織の消化を最適化します。抗生物質(Ca2+/Mg2+ -free DPBS、1% Penicillin/Streptomycin、0.25 mg/mL Amhotericin B /10 mg/mL Gentamicin、50 mg/mL Kanamycin)を添加したCa2+/Mg2+ -free DBPSで組織断片を洗浄し、血液がなくなるまで洗浄します。.必要に応じて複数回の洗浄を行います。滅菌ガーゼを通して洗浄液を慎重にろ過して廃棄物ビーカーに入れ、洗浄液を廃棄します。
- 洗浄したフラグメントを、25 mmの攪拌子と予め加温したインキュベーション培地(2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM HEPESバッファー、1 mg/mLコラゲナーゼ1型、2 mg/mL細胞培養グレードのウシ血清アルブミンを添加した基礎培地)を備えた125 mLガラス丸底フラスコに集めます。丸底フラスコをゴム製のセプタムで密封します。
- 20Gの脊髄針を中隔に挿入し、ゴム製のホースで酸素ボンベに接続します。汚染物質をろ過するには、ティッシュペーパーをチューブに挿入してフィルターを作成します。酸素流出を低でオンにします。10〜15本の流出針を中隔に挿入して、中隔の破裂を防ぎます。
- クランプを使用してセットアップをリングスタンドに固定し、攪拌板を使用して37°Cに校正したウォーターバスに30〜45分間入れます。組織を15分間インキュベートした後、インキュベーション培地50 μLを取り出し、腺が解離していないか目視で確認します。腺が密集していないか、組織から分離していない場合は、さらに5〜10分間放置します。
- インキュベーション直後に、滅菌血清学的ピペットを使用するか、インキュベーション混合物に直接注いで、予熱したDMEM/F-12を50 mLのインキュベーション培地に加えます。
- 腺混合物を滅菌ガーゼでろ過し、4本の50mLコニカルチューブに入れます。濾液を氷上に15分間保持して、抽出された腺が円錐管の底に沈殿するのを待ちます。落ち着いた腺を乱さないように注意してください。血清学的ピペットを使用して、上部40 mLの上清を取り除き、廃棄します。.残りの10 mLを、抗生物質を添加したDPBS10 mLに再懸濁します。.
- 混合物を5 mLの細胞培養試験管に均等に分配します。65 x g、4°Cで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます
手記：このステップを氷の上で行い、混合中に基底膜マトリックスの重合を避けることが重要です。さらに、50 μLのサンプリングにより、グランド密度を目視で検査することが重要です。最適な密度は ~70% のコンフルエンシーです。 - 次に、先端の広いピペットを使用して、50 μLの基底膜マトリックスにグランドをプレート化します。めっき中に気泡が発生しないようにしてください。
- 基底膜マトリックスを重合させるには、37°Cで10〜15分間インキュベートします。12ウェル培養プレートにプレーティングする場合は、1 mLのhFGO培地(Advanced Dulbeccoの改変Eagle培地/F-12培地に2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 mg/mLアムホテリシンB /10 mg/mLゲンタマイシン、50 mg/mLカナマイシン、10 mM HEPESバッファー、1 mM n-アクテイルシスチン、1 x N2、1 x B27、 ウェルあたり50%Wntコンディショニング培地、20%R-スポンディンコンディショニング培地に100 ng/mL骨形態形成タンパク質阻害剤、1 nMガストリン、50 ng/mL上皮成長因子、200 ng/mL線維芽細胞成長因子10、10 mMニコチンアミド、および10 μM Y-27632 ROCK阻害剤を添加。12ウェル培養プレートを使用しない場合は、基底膜マトリックスの泡を沈めるのに十分な培地を追加します。
- 細胞を5% CO2加湿細胞培養インキュベーターで37°Cで培養します。メディアは4〜5日ごとに交換してください。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Ca2+/Mg2+フリーDPBS | 漁夫 | 21-031CV | |
| 滅菌ガーゼ | |||
| 湾曲止血鉗子 | |||
| 滅菌ペトリ皿 | |||
| 滅菌カミソリの刃 | |||
| アドバンスドダルベッコ修正イーグル/ F12ミディアム(基礎メディア) | ライフテクノロジー | 〒12634-010 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | サーモサイエンティフィック | SV30010 | |
| アムホテリシンB/ゲンタマイシン | サーモサイエンティフィック | R01510 | |
| GlutaMAX(L-グルタミン) | ライフテクノロジー | 〒25030-081 | |
| カナマイシン | サーモフィッシャー | RO1510 | |
| コラゲナーゼ1型 | ワージントン | LS004214 | |
| ウシ血清アルブミン | シグマ・アルドリッチ | A9418の | |
| HEPESバッファー | シグマ・アルドリッチ | H0887-J | |
| 125mL丸底フラスコ | |||
| 1インチ(25 mm)攪拌子 | |||
| ラバーセプタム | |||
| 長さ3.5Gの脊椎針20G | サーモフィッシャー | 405182 | |
| キムワイプ(ティッシュペーパー) | フィッシャーサイエンティフィック | 06-666C | |
| ゴム製ホース付き酸素タンク | |||
| リングスタンドクランプ | |||
| 37 °C ウォーターバス | |||
| 5 mL細胞培養試験管 | 漁夫 | 14-956-3C |
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