腸陰窩の分離:マウスモデルの小腸から全陰窩を分離する方法

要約

出典:Schewe, M. et al.腸幹細胞およびニッチ細胞の機能解析のためのオルガノイド再構成アッセイ(ORA)。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、マウスの小腸から陰茎全体を分離するテクニックを実演します。分離された全陰窩は、in vitroで長寿命で自己複製する3Dオルガノイドを増殖するために使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 器具、培地、食器の準備

1. 腸ハサミ、通常のハサミ、鉗子の1セットを滅菌容器にオートクレーブします。
2. 96ウェル(平底)ディッシュを37°Cのインキュベーターに入れます。
3. 10 mLの完全培地を、材料表に記載されている試薬で調製します。
4. 完全な培地を37°Cのウォーターバスでインキュベートします。
5. 基底膜を氷のバケツに入れて再構成しました。再構成された基底膜は、4°Cで液体になります。
6. 4つのシャーレに冷たいリン酸緩衝生理食塩水またはPBS(4°C)を入れます。

2. 小腸陰窩の分離

1. C57BL6/Jの背景にLgr5-eGFP-IRES-CreER^t2マウスを_CO2吸入で犠牲に。ハサミで腹膜を縦方向に解剖します。
2. 鉗子で胃を持ち、横方向に半分に切ります。
3. これから腸ハサミを使って腸を引き出し、PBSの入ったシャーレに入れます
   手記：腸ハサミは鋭くて鈍い先端を持っています。これらのはさみの鈍い先端は、腸を開くときに陰窩絨毛の構造を損傷しないようにするためのものです。
4. 鈍い先端を胃に入れることから始め、幽門にそっと押し込みます。ハサミで切り、鉗子で引っ張って進めます。
5. 小腸全体が縦方向に開いたら、鉗子で保持して冷たいPBSで洗い、U字型の動きでPBS溶液でやさしくすすぎます。
6. 便の残りがすべて取り除かれたら、まな板の上で腸を平らにし、管を上にして進めます。管腔側は、血管がなく、外側の部分と比較するとその淡い外観によって容易に認識できます。
7. スライドガラスで、扁平になった腸をこすり落とすようにして絨毛をやさしく取り除きます。この手順を組織の全長に沿って2回実行します。
8. 滅菌外科用ブレードで小腸を2〜5mmに切ります。
9. 氷冷PBS10mLが入った50mLチューブに小腸の断片を入れます。
10. 組織の断片を洗浄し、PBS内でピペッティングして残っている不純物を取り除きます。上清を捨て、PBSが完全に透明になるまでこの手順を繰り返します。
11. 15 mLの冷たいPBSを加えて、PBSの合計最終容量を25 mLにします。2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加し、ローラー上で4°Cで45分間インキュベー
トします。
12. PBS/EDTAを廃棄します。
13. PBS10 mLを加え、組織片を上下に激しくピペッティングして陰窩を切り離します(少なくとも3回)。上清を集めます。
14. 手順2.13を4回繰り返します。培地を加えて、最終容量50 mLにします。
15. 遠心分離(300 x gで5分間)により細胞をペレット
化します。
16. ペレットを10 mLの培地に再懸濁し、遠心分離(80 x gで3分間)により陰茎をペレット
化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アドバンスドDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒12634-010
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	最終濃度:1%
グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061	最終濃度:10 mM
ヘペス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080	最終濃度:10 mM
組換えマウスEGF	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PMG8041	最終濃度:50 ng / ml
組換えマウス Noggin	ペプロテック	250-38	最終濃度:100 ng / ml
27632円	シグマ	0503年度	最終濃度:10 μM
Jagged-1 (ギザギザの 1	Anaspec	AS-61298	最終濃度:1 μM
組換えマウス R-spondin	研究開発体制	3474-RS-050	最終濃度:1 mg / ml
B6.129P2-LGR5TM1(CRE/ERT2)Cle/J	ジャクソン研究所	8875
低結合チューブ	エッペンドルフ	Z666548-250EA