ニワトリCAMからの転移性がん細胞コロニーの単離:殻なし卵培養物からがん細胞を単離する手順

要約

出典: Stoletov, K. et al. Discovery of Metastatic Regulators Using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、殻なし卵培養物を使用して、ニワトリ絨毛尿膜(CAM)からの転移性がん細胞コロニーの分離について説明します。 この方法は、がんの転移の原因となる可能性のある因子をスクリーニングするのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 転移性コロニーの分離

1. 注射後5日目に、インキュベーターから胚を取り出し、胚CAMの転移性コロニー分布を検査します。コンパクトな(または過度に侵襲的な)コロニーが存在する均一なコロニー分布を持つ胚を特定します。
   手記：ニワトリ胚の培養プロセスは無菌ではないため、将来の組織培養汚染を避けるために、すべてのスクリーニングステップを高度にクリーンな条件下で実行する必要があります。汚染は非常にまれであり、手袋とマスクを着用し、細胞注入およびコロニー分離手順中に滅菌ツールのみを使用することで簡単に回避できます。胚を1つずつ検査して、実験室の周囲温度への曝露を減らし、汚染を防ぐことをお勧めします。
2. 目的の転移性コロニーを見つけます。コンパクトなコロニーとは、ほとんどのがん細胞がCAM組織の限られた領域内にあるコロニー(細胞が「凝集」しているように見える)のコロニーと表現できます。浸潤性コロニーは、がん細胞がCAM組織に「散らばる」コロニーとして説明できます(図1A、B).
   注:転移性コロニーの「コンパクト性」は、がん細胞の浸潤の阻害、がん細胞の増殖の阻害、またはその両方によって説明できます。すべてのシナリオに注意を払う必要があり、接触コロニーを分離する必要があります(図1A、B)。単純な蛍光実体顕微鏡を使用して、コンパクトな転移性コロニーの表現型と浸潤性の転移性コロニーの表現型を区別できます。
3. 解剖顕微鏡下で、目的の転移性コロニーを含むCAM組織を細い鉗子を使用してゆっくりと上方に引っ張ります(図1C)。
4. 転移性コロニーを含むCAM組織を手術用ハサミで切り取ります。
5. 転移性コロニーを含むCAM組織を空の滅菌1.5mLチューブ(氷上)に移し、チューブの蓋を閉じます
   手記：単離されたコロニーは、生存能力を損なうことなく、最大3時間氷上に保持できます。
6. 目的のすべてのコロニーが別々のチューブに集められるまで、切除手順を繰り返します。動物の苦しみを避けるために、1つの胚から2〜3コロニー以上を切除しないでください。コロニー切除の直後に-20°C(または別の承認された方法)で凍結することにより、胚を安楽死させます。
7. 滅菌済みの18G針を使用して、微量遠心チューブ内のCAM組織を穏やかにミンチします。コロニーごとに別々の針を使用してください。
8. 1xコラゲナーゼ溶液100 μLを加え、37°Cで30分間インキュベー
トします。
9. 細胞およびCAM組織を300 x gで周囲温度で5分間スピンダウンします。
10. コラゲナーゼ溶液を吸引し、目的の細胞株に使用した完全培地に細胞を再懸濁します
    手記：通常、コラゲナーゼ処理後にCAM組織が完全に解離することはなく、がん細胞はまずCAM組織片内で増殖し、その後、組織培養皿上に移動します。
11. 細胞とCAM組織を再び300 x gで周囲温度で5分間回転させます。
12. 細胞とCAM組織片を1 mLの完全培地と選択因子(存在する場合)に再懸濁し、1つの12ウェル組織培養皿に移します><。 手記：ニワトリCAM線維芽細胞は、クローン増殖を阻害する複数の継代にわたって組織培養中に持続する可能性があります。選択因子の存在下で転移性コロニーを拡大する能力(すなわち、がん細胞を蛍光化するために使用されたベクターが哺乳類の抗生物質耐性遺伝子もコードしている場合)は、クローン増殖を大幅に加速する可能性があります。スクリーニングの前にキルカーブ実験を実施して、適切な濃度の抗生物質が使用されていることを確認する必要があります。
13. 次の1〜3週間は、がん細胞の増殖と汚染について毎日監視します。
14. 細胞が70〜80%の密度に達したら、細胞をより大容量の培養皿に移します><。 手記：各クローンの少なくとも2つの極低温バイアルを凍結できるようになるまで細胞を増殖させることをお勧めします。大量の組織培養を維持することは、面倒で不必要になる場合があります。
15. 十分ながん細胞数に達したらすぐに、シーケンシングまたは次の選択ラウンドに進みます。一般に、がん細胞の1 x 10⁶は、最新のハイスループットシーケンシング技術には十分です。
16. クローン再注入に進み、コロニーのコンパクトさまたはがん細胞と血管の接触のイメージングと定量化を行います(図2A)。あるいは、ハイスループットシーケンシングに進むか、コロニー選択を繰り返します.
    注: 誤検出の数を減らすには、少なくとも 2 ラウンドの選択をお勧めします。2つのアプローチが成功裏に採用されています。1)各クローンを拡大し、個別に再注入してコロニー表現型を確認します。2)すべての拡張クローンをそれぞれ1:1の比率で混合し、混合物として再注入し、選択サイクルを繰り返します。

結果

図 1.スクリーニングプロトコルのさまざまなステップの代表的な結果。(A)不均一性(ライブラリー形質導入がん細胞株HEp3細胞)によって形成された転移性コロニー、注射後5日。赤い矢印は、切除すべきコンパクトなコロニー(陽性の可能性がある)を示しています。(B)再注入後、注射後5日目に単離されたスクリーニングヒット(KIF3B)の1つによって形成された転移性コロニー。挿入図は、破線の正方形からデジタル的に切り取られた転移性コロニー画像を示しています。これは、C.I定量に許容できる画質です。ヒット再注入の平均C.I.値(KIF3B)を示します。(C)CAM組織からの目的の転移性コロニーの単離。(D)コントロ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15mLの円錐形遠心チューブ。	コーニング	CLS430791-500EA
18ゲージ×1 1/2 BD精密 針	BDの	BD305196	1.2mm×40mmを使用し、可能 必要に応じて短い針を使用すること
卓上型遠心分離機。	多くの情報源が利用可能です		TC互換の遠心分離機 細胞をスピンダウンするために使用できます 適した
コラゲナーゼ	シグマ	C0130-100MG
綿棒	多くの情報源が利用可能です		使用前に滅菌する必要があります
細胞に適した培地 使用する行	多くの情報源が利用可能です		HT1080、HEp3、b16 cell を栽培しています DMEMのライン、10%FBSメディア
卵インキュベーター	多くの情報源が利用可能です		必要な正確なモデル 画面のスケールによります。 利用可能なソースはMGF Company です。 Inc.、ジョージア州サバンナ、またはLyon Electric Company Inc.、カリフォルニア州チュラビスタ
エッペンドールチューブ、1.5ml	シグマ	T4816-250EA
受精した白いレグホーンの卵	地元の供給業者
細かい鉗子	多くの情報源が利用可能です		使用前に滅菌する必要があります
画像解析ソフトウェア			Nikon Elementsを使用しています
PBSの(1x)	多くの情報源が利用可能です
プラスチックウェイト皿	インポート	CA11006-614	寸法は78x78x25mmで、多 他の情報源が利用可能です
小さな手術用ハサミ	多くの情報源が利用可能です		使用前に滅菌する必要があります
実体蛍光顕微鏡			Zeiss Lumar v12を使用しています

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