出典:Prasad, M. et al. アデノ随伴ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部がん細胞株のin vitroでの樹立。J. Vis. Exp.(2020年)
このビデオでは、マウスの舌から上皮細胞が分離される様子を説明しています。これらの細胞をさらに培養して、細胞コロニーを生じさせることができます。
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方法論記事
マウス舌上皮細胞の単離と培養:マウスモデルから舌上皮細胞を単離および培養する手順
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 初代細胞の単離と培養
- 生後6週齢の男性または女性のB6を安楽死させます。129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)FEZH/J CO₂窒息またはその他のIACUC承認プロトコルによる.
手記：これらのCRISPR/Cas9ノックインマウスは、CAGプロモーターによって指示されるCas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPのCreリコンビナーゼ依存的な発現を有する。これらのマウスのゲノムに存在する上流のLox-Stop-Lox(LSL)配列は、Creリコンビナーゼの不在下でのCas9およびEGFPの発現を防ぎます。シングルガイドRNA(sgRNA)およびCreソースと組み合わせて使用すると、in vivoまたはex vivoで単一または複数のマウス遺伝子の編集が可能になります。 - 外科用ハサミを使用して、安楽死させたマウスから舌を解剖します。
- メスを使用して舌組織を非常に小さな断片にミンチすることにより、組織を手動で解離します。組織片を4.5 mLのRPMIプレーン培地(血清なし)を含む15 mLチューブに集めます。
- トリプル酵素ミックス(200 μL)(レシピは表1を参照)を組織片に加えます。
- 組織-酵素ミックスを37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを軽くたたいて、組織の酵素的解離を促進します。
- HBSS/PBSを含む5%ウシ胎児血清(FBS)を組織-酵素ミックスに加え、酵素の作用を止めます。
- 上記の細胞懸濁液を滅菌済みの70μmナイロンメッシュでろ過し、分散した細胞とより大きな組織片を分離します。
- ろ過した細胞懸濁液を300 x gで5分間、HBSS/PBS中RTで遠心分離して洗浄します。
- ペレットを培地(RPMI/DMEM中の10% FBS)に再懸濁し、60 mmの培養皿で明確な細胞コロニーが形成されるまで増殖させます。
- 培養細胞凝集体は、細胞コロニーが形成されるまで、3 mLの完全培地(RPMI/DMEM中の10% FBS)を含む60 mmの培養皿でフィルターの上部に保持されます。
- 1週間の培養後に初代細胞に線維芽細胞の汚染が存在するかどうかを顕微鏡で調べます。凝集体および細胞懸濁液から発生した初代細胞を0.25トリプシン0.02%EDTA溶液で37°Cで1分間処理し、線維芽細胞を除去します。
手記：通常、細胞凝集体からの一次培養物は、単一細胞懸濁液と比較してより多くのコロニーを生成します。これらのコロニー由来の細胞は、AAV形質導入によりより優れた形質導入効率を提供します。
| 10X トリプル酵素ストック溶液: | |
| コラゲナーゼ | 1 gの最終濃度[10 mg / mL] |
| ヒアルロニダーゼ | 100 mg [1 mg/mL] |
| DNase | 20,000 Units final conc. [200 mg/mL] |
| PBSの1X | 100mLまで作る |
表1:この研究で使用したバッファーのレシピ
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| マウス系統 | |||
| C57BL/6 | エンビゴ | ||
| B6;129-GT(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)フェッシュ/J | ジャクソン研究所 | 24857 | |
| 頷く。CB17-PRKDC-SCID/NCr Hsd (Nod.Scid) | エンビゴ | ||
| 酵素 | |||
| ベンゾナーゼ | シグマ | E1014 | |
| コラゲナーゼIV | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17104019 | |
| DNAse | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 18047019 | |
| ヒアルロニダーゼ | ミリポアシグマ | H3506-J | |
| トリプシン | バイオロジカルインダストリーズイスラエルBeitHaemek株式会社 | 03-050-1B | |
| 培地、化学薬品、試薬 | |||
| BSAの | アムレスコ | 0332-タム-50G | |
| DMEM | バイオロジカルインダストリーズイスラエルBeitHaemek株式会社 | 01-055-1A | |
| FBSの | バイオロジカルインダストリーズイスラエルBeitHaemek株式会社 | 04-127-1A | |
| HBSSの | シグマ | H6648-J | |
| PBSの | バイオロジカルインダストリーズイスラエルBeitHaemek株式会社 | 02-023-1A | |
| トリスバッファ | メルクミリポア | 648311から1キロ | |
| プラスチック製品 | |||
| アミコンウルトラフィルター100KDa | ミリポア | UFC910024 | |
| 0.22 μm 滅菌フィルター、4 mm | ミッレクス | SLGV004SL | |
| 0.45 μm 滅菌フィルター、13 mm | ミッレクス | SLHV013SL | |
| 培養プレート | グライナーバイオワン | ||
| ファルコンチューブ | グライナーバイオワン |
