RNA CIHのFFPE組織前処理:RNA発色性In situハイブリダイゼーションのためのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を処理する手順

要約

出典:Outh-Gauer, S. et al. HPV関連の頭頸部がん診断のためのツールとしての発色性In Situハイブリダイゼーション。 J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、FFPE組織標本のRNA発色in situハイブリダイゼーションの前処理手順を示しています。前処理プロセスは、細胞内および組織全体の形態内の核酸の完全性を維持するのに役立ちます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 材料の準備

1. 1xターゲットリトリーバル試薬の調製
   1. 大きなビーカーで、70 mLの10倍ターゲット回収試薬(材料表を参照)を630 mLの蒸留水に加えます。
   2. ビーカーをマグネチックスターラー付きの加熱プレートに置きます。アルミホイルで覆います。
   内容物を
   3. 100°Cで10〜15分間煮沸します
      注意: 30分以上沸騰させないでください。

2. 組織の前処理

>注:これらの手順は、頭頸部サンプルの製造元の指示に従って、「標準」の前処理推奨に従います。セクション2.1および2.2のタイミングは、操作する組織に応じて調整する必要がある場合があります。

1. ペルオキシダーゼ活性の遮断
   1. 各スライドに4〜6滴の過酸化水素(材料表を参照)を加え、室温で10分間インキュベー
   トします。
   2. スライドを室温の蒸留水で2分間2回洗浄します。
2. RNA/組織結合の切断
   1. 加熱プレートに載せた沸騰した1xターゲット回収試薬(TTR1x)からアルミホイルを爪で取り除き、攪拌を止めます。スライドラックをゆっくりと、非常に慎重に15分間浸します。ビーカーを再度アルミホイルで覆います.
      手記：このステップの間、煮詰めは持続する必要があります.
      注意：爪を使ってアルミホイルとスライドラックを操作し、火傷をしないようにします。手袋や白衣などの適切な個人用保護具を着用してください。
   2. 爪で、すぐにホットスライドラックを蒸留水浴に移し、2分間洗浄します
      手記：TTR1xでサンプルが冷えないようにしてください。
   3. スライドを新鮮な100%エタノールで2分間洗浄します。
   4. スライドを室温で2分間乾燥させます。
3. バリア作成
   1. 疎水性バリアペン(材料の表を参照)を使用して、サンプルの周りにバリアを描きます。少なくとも5分間乾かします.
      手記：バリアが本当に乾くのを待ちます。施術中に摩耗した場合は、迷わず再度描き直してください。ペンでティッシュに触れないでください。プロトコルはここで一晩一時停止できます。
4. プロテアーゼ消化
   1. スライドをスライドラックに置き、サンプルごとに~4滴のProtease Plusを追加します(材料の表を参照)。
   2. 湿度制御トレイを蓋で覆い、ハイブリダイゼーションオーブンに40°Cで30分間挿入します
      手記：蒸発を防ぐため、ターンノブが完全にロック位置に回されていることを確認してください。
   3. トレイをオーブンから取り出し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1枚のスライドで、余分な液体をすばやく取り除き、蒸留水で満たされた染色皿に沈められたスライドラックにスライドを置きます。
   5. スライドを室温の蒸留水で2分間2回洗浄します。絶えず攪拌します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HybEZオーブン(110v)	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	321710
HybEZスライドラック	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	300104
ImmEdge疎水性バリアペン	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	310018
RNAscope H202 & Protease Plus 試薬	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	322330	過酸化水素 x2 および プロテアーゼ Plus x 1
RNAscopeターゲット検索試薬	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	322000