RNA In Situハイブリダイゼーションにおけるプローブハイブリダイゼーションとシグナル増幅:組織切片中の特定のRNA配列を検出するための技術

要約

出典:Outh-Gauer, S. et al. HPV関連の頭頸部がん診断のためのツールとしての発色性In Situハイブリダイゼーション。 J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、mRNAプローブを特定の標的mRNAにハイブリダイズするシーケンシャルハイブリダイゼーション戦略について説明しています。プローブハイブリダイゼーションに続いて、組織学的サンプルのRNA-CISH中にシグナル対ノイズ比を減少させることにより分解能を向上させるために、シグナル増幅が行われます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. アッセイの実行

>注:インキュベーションステップの間に切片を乾燥させないでください。

1. HPVプローブのハイブリダイゼーション
   注意: 使用前に、プローブが沈殿物を溶解するために予熱されていることを確認してください。このステップでは、HPV プローブの代わりに、ポジティブコントロール用のペプチジル-プロリルイソメラーゼ B(PPIB)またはネガティブコントロール用のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(DAPB)(材料表を参照)も使用できます。
   1. スライドをタップまたはフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに入れます。HPVプローブを~4滴加えて、各セクションを完全に覆います。
   2. トレイに蓋をしてオーブンに40°Cで2時間挿入します
      注意: 蒸発を防ぐために、ターンノブが完全にロック位置に回されていることを確認してください。
   3. トレイをオーブンから取り出し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1枚のスライドで、余分な液体をすばやく取り除き、1x洗浄バッファーで満たされた染色皿に浸したスライドラックにスライドを置きます。
   5. スライドを1x洗浄バッファーで室温で2分間、一定の攪拌で洗浄します。これを新しい1x洗浄バッファーで繰り返します。
2. AMP1、AMP2、AMP3、およびAMP4 注:これらのステップには、ハイブリダイゼーションオーブンでのハイブリダイゼーションと、購入したキットからのAMP1〜AMP4が含まれます(材料の表を参照)。
   1. タップまたはフリックして、スライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに置きます。AMP1を~4滴加えて、各セクションを完全に覆います。
   2. トレイに蓋をして、オーブンに40°Cで30分間挿入します。
   3. トレイをオーブンから取り出し、スライドラックを取り外します。
   4. 一度に1枚のスライドで、余分な液体をすばやく取り除き、1x洗浄バッファーで満たされた染色皿に浸したスライドラックにスライドを置きます。
   5. スライドを1x洗浄バッファーで室温で2分間、一定の攪拌で洗浄します。これを新しい1x洗浄バッファーで繰り返します。
   6. 手順1.2.1〜1.2.5を繰り返しますが、AMP1の代わりにAMP2を~4滴使用し、40°Cで15分間インキュベートします。スライドを2回、2分間、どちらも新鮮な洗浄バッファーで洗浄します。
   7. 手順1.2.1〜1.2.5を繰り返しますが、AMP1の代わりにAMP3を~4滴使用し、40°Cで30分間インキュベートします。
   8. 手順1.2.1〜1.2.5を繰り返しますが、AMP1の代わりにAMP4を~4滴使用し、40°Cで15分間インキュベートします。
3. AMP5とAMP6 注:これらのステップには、オーブンでのハイブリダイゼーションは含まれていませんが、室温でのハイブリダイゼーションは含まれていません。AMP5 と AMP6 は、購入したキットから入手できます (資料の表を参照)。
   1. スライドをタップまたはフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに入れます。AMP5を~4滴加えて、各セクションを完全に覆います。
   2. トレイに蓋をして、室温で30分間インキュベー
   トします。
   3. 一度に1枚のスライドで、余分な液体をすばやく取り除き、1x洗浄バッファーで満たされた染色皿に沈めたスライドラックに入れます。
   4. スライドを1x洗浄バッファーで室温で2分間、一定の攪拌で洗浄します。これを新しい1x洗浄バッファーで繰り返します。
   5. 手順 1.3.1 から 1.3.4 を繰り返しますが、AMP5 の代わりに AMP6 を ~4 滴使用し、室温で 15 分間インキュベートします。スライドを 2 回 2 分間、どちらも新鮮な洗浄バッファーで
   洗浄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HybEZオーブン(110v)	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	321710
HybEZスライドラック	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	300104
RNAscope 2.5 HD検出試薬-BROWN	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	322310	このキットには、増幅試薬AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5、AMP6、および検出試薬DAB-AおよびDAB-Bが含まれています
RNAscope 3-Plex ネガティブコントロールプローブ	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	320871	ダップビー
RNAscope 3-Plex ポジティブコントロールプローブ	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	320861	PPIB
RNAscopeプローブ - HPV16/18	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	311121
RNAscope洗浄バッファー試薬	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	310091	ウォッシュバッファー50X x4

の