RNA CISH シグナル検出:無傷組織標本における RNA In Situ ハイブリダイゼーション中の発色シグナル検出技術

要約

出典:Outh-Gauer, S. et al.HPV関連の頭頸部がん診断のためのツールとしての発色性In Situハイブリダイゼーション。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、RNA発色in situハイブリダイゼーション中のシグナル検出のプロトコルを紹介しています。この手法は、無傷の組織標本で活動性の発がん性感染症を視覚的に診断するために使用できます。

プロトコル

1. 対比染色試薬の調製

1. 50%ヘマトキシリンを調製します。
   1. ドラフトで、染色皿の蒸留水100 mLに100 mLのGill's hematoxylin I(材料の表を参照)を加えます><。 手記：50%ヘマトキシリン染色液は、最大1週間再利用できます。
2. 0.02%(w / v)アンモニア水(ブルーイング試薬)を調製します。
3. ドラフトで、メスシリンダーまたは別の容器内の蒸留水250 mLに1 N水酸化アンモニウム1.43 mLを加えます。.シリンダーをパラフィンフィルムで密封します。その内容物を3x–5x.
   によく混ぜます 手記：アッセイの定量には、水酸化アンモニウムを使用することが重要です。試薬は事前に調製することができます。すべてのコンテナが覆われたままであることを確認してください。

2. 3,3'-ジアミノベンジジンによるシグナル検出

>注意:ジアミノベンジジン(DAB)は有毒です。この化学物質を廃棄および取り扱うときは、適切な予防措置と安全ガイドラインに従ってください。

1. 各溶液を同数の滴分注することにより、適切なサイズのチューブに等量のDAB-AとDAB-B(材料の表を参照)を混合します。切片あたり~120 μLのDAB基質を調製します(各試薬を~2滴/合計4滴)。3倍から5倍によく混ぜます。
2. スライドラックから各スライドを一度に1つずつ取り出し、タップまたはフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに入れます。
3. ~120 μL の DAB を各組織切片にピペットで移します。切片が覆われていることを確認し、室温で10分間インキュベー
トします。
4. 残りのDABは地域の規制に従って廃棄し、水道水で満たされた染色皿に沈められたスライドラックにスライドを挿入します。

3. 対比染色

1. スライドラックを50%ヘマトキシリン染色溶液を含む染色皿に移し、室温で30秒間休ませます。スライドが紫色になることに注意してください。
2. すぐにスライドラックを水道水が入った染色皿に戻し、ラックを上下に動かしてスライドを3〜5回洗います。
3. スライドが透明になり、セクションが紫色のままになるまで、新鮮な水道水で洗浄手順を繰り返し続けます。
4. 染色皿の水道水を0.02%アンモニア水に交換してください。ラックを上下に 2 倍から 3 倍に動かします。ティッシュセクションが青色に変わることに注意してください。
5. アンモニア水を水道水に交換します。スライドを3〜5回洗います。

4. 脱水症状

1. スライドラックをヒュームフードに70%エタノールが入った染色皿に移し、時々攪拌しながら2分間休ませます。
2. スライドラックを100%エタノールを含む最初の染色皿に移し、時々攪拌しながら2分間休ませます。
3. スライドラックを100%エタノールを含む2番目の染色皿に移し、時々攪拌しながら2分間休ませます。
4. スライドラックをキシレンを含む染色皿に移し、時々攪拌しながら5分間休ませます。

5. スライドマウント

1. スライドをスライドラックから取り外し、セクションを上に向けてドラフトに平らに置きます。
2. 各スライドにキシレンベースの封入剤を1滴加え、24 mm x 50 mmのカバースリップをセクションに慎重に配置して、一度に1つのスライドをマウントします。気泡を閉じ込めないでください。
3. スライドを≥5分間風乾します。

6. サンプル評価

1. 標準的な明視野顕微鏡で組織切片を20倍〜40倍の倍率で観察します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヘマトキシリン溶液 ギルNo.1	メルク	GHS132
RNAscope 2.5 HD検出試薬-BROWN	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	322310	このキットには、増幅試薬AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5、AMP6、および検出試薬DAB-AおよびDAB-Bが含まれています
RNAscopeプローブ - HPV16/18	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	311121
HybEZスライドラック	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	300104
ImmEdge疎水性バリアペン	アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス(株)	310018

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