ラットの背骨からのDRGの収穫:ラットモデルの背骨から背根神経節を抽出する手順

要約

出典:Schmidt, L. B. et al.頭頸部がんの神経周囲浸潤を評価するためのひよこ絨毛尿膜In vivoモデル。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、採取したラットの脊椎から後根神経節またはDRGを抽出し、下流に応用する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. DRGの収穫と準備(推定タイミング:8日目の2時間)

>注:マウスとラットでの実験には、IACUCからの承認が必要です。一部の国では、鶏の卵の使用にも承認が必要です。

1. 生後6〜7週間のSprague Dawleyラット(体重~200 g)を入手してDRGを抽出します><。 手記：1匹のラットは、~40個の頸部および胸部のDRGを産むはずです。マウスのDRGもCAMに統合されます。ただし、この種の条件は個別に最適化する必要があります。
2. 層流キャビネットでは、他の場所で公開されているマウスDRG抽出のプロトコルに従って、頸部および胸部領域からDRGを採取します。図1に従って、DRGの収集方法のオリエンテーションを示します。
   1. 腹腔内に注射されたケタミン/キシラジンの投与後、心臓穿刺によってラットを安楽死させます。ラットの皮膚を70%エタノールで洗浄し、ハサミを使用してラットの背骨を取り除きます。子宮頸部脱臼は、子宮頸部DRGを損傷するため、行わないでください。
   2. 図1A-Dに示されている概略的な解剖学的表現と肉眼的な画像に従って、同じハサミで頸椎、胸部、および腰椎の領域を分離します。脊椎切片を1X PBSを入れた10 cmの培養皿に入れて、組織を濡らし続けます。
   3. 繊細な骨ハサミで、背側と腹側の椎骨を開き、脊椎を2つの側方半分に分けます(図1E-F)。 新しい1X PBSを入れた清潔な10cmの皿に組織切片を置きます。
   4. 鉗子を使用して、脊髄を椎骨からそっと切り離し、DRGを視覚化します(図1G)。
   5. 各DRGの下に細い鉗子を挟み、つかんで、それが詰まっている骨腔から引き出します。DRGを直接保持すると、組織が損傷する可能性があるため、保持しないでください。DRGから軸索束をトリミングしないでください(図1H)。
      手記：ランバーDRGはCAMへの統合が減少するため、使用しないでください。DRG 領域の位置については、図 1A-D の概略図と肉眼解剖図に従います。
3. 収穫後すぐに、各DRGを2%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)および10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM培養培地に入れて、DRGの細菌汚染を防ぎます。
4. すべてのDRGを回収した後、2%ペン/連鎖球菌と10%FBSを添加し、1.25 μg/mLの赤色蛍光色素を含むDMEM培地を新しい培養皿に移します。細胞培養インキュベーターで1時間インキュベートします。

結果

図 1:8日目のDRG抽出。A.脊椎の解剖学的位置を示すラットの概略図。B.さまざまな体の領域を示すラットの椎骨構成の図。頸椎は緑、胸部は紺色、腰椎はオレンジ、仙椎は水色です。C-D.外科的切除後のラット脊椎の腹側側面;Bに示すような領域の分離。E. 脊髄管を開くための椎骨の解剖、DRGを含む2つの側方セクションに椎体を分離します。セクションは、正中線で各椎骨の背側と腹側の側面を切断する必要があります。F.開いた胸椎の全体的な側面。G.脊髄が変位した後、DRGは脊柱管で簡単に見えます(矢印の先端は3つのDRGを指しています)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBS(1x)pH 7.4	ギブコ	#10010-023	リン酸緩衝生理食塩水
Sprague Dawleyラット(メス)	チャールズリバー研究所	ひずみコード:001	生後6-7週齢(体重190-210g)
デュモン#5細かい鉗子	ファインサイエンスツール(FST)	#11254から20	DRGの収穫に使用
極細グレーフ鉗子、湾曲	ファインサイエンスツール(FST)	#11151-10	8日目にDRGをCAMにグラフトし、17日目にCAM組織を採取するために使用されます
極細グレーフ鉗子、ストレート	ファインサイエンスツール(FST)	#11150から10	8日目にDRGをCAMにグラフトし、17日目にCAM組織を採取するために使用されます
DMEMの(1x)	ギブコ	#11965-092	ダルビーコのモディファイドイーグルミディアム
CellTracker Red CMTPX蛍光色素	ライフテクノロジー	#C34552	40μLのDMSOに50μgを溶解し、-20°Cでストックします。1μLの原液/1mLの培地を使用してください
ペン/連鎖球菌	ギブコ	#15140-122	10,000ユニット/mLペニシリン、10,000μg/mLストレプトマイシン
こんにちはFBS	ギブコ	#10082-147	熱不活化ウシ胎児血清
DMSOの	フィッシャーバイオ試薬	#BP231-100	ジメチルスルホキシド