ひよこ絨毛尿膜またはCAM腫瘍モデル:腫瘍細胞の神経周囲浸潤をシミュレートするためのInOvo法

要約

出典:Schmidt, L. B. et al.頭頸部がんの神経周囲浸潤を評価するためのひよこ絨毛尿膜In vivoモデル。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、ヒヨコ絨毛膜またはCAMで後根神経節と癌細胞を共培養して神経周囲浸潤を研究する方法について説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. CAMでのDRGのグラフト化(予定時間:8日目40分)

1. HBSS培地で6cmの培養皿を準備し、移植前にDRGを洗浄します。調製した卵を細胞培養層流キャビネットに持って行きます。卵からパラフィン膜を取り除きます(図1A)。
2. 細かい滅菌鉗子で、培地の中から1つのDRGを優しくつかみます。HBSS培地に浸して、蛍光色素を含む余分な培地を取り除きます。DRGを非常に優しく持ちます。そうしないと、鉗子にくっついてしまいます。
3. メンブレンに穴を開けないように注意しながら、DRGをCAMに置きます(図1B-C)。必要に応じて、別の鉗子のペアを使用して、DRGをCAMに配置するときに鉗子の先端からDRGを取り外すのを助けます。
   手記：DRGをHBSS培地で濡らしておくと、鉗子からの脱落も容易になります。
4. 卵を滅菌透明フィルムドレッシングで覆います。細菌汚染を避けるために、卵殻に開けられたすべての窓と穴を覆います(図1D)。
5. すべての卵にDRGを接ぎ木した後、卵を38°C、湿度54%の加湿インキュベーターで2日間、回転せずにインキュベートします。

2. CAMでの腫瘍細胞の移植(推定タイミング:10日目1時間30分)

1. 細胞を移植する48時間前に、必要な細胞を培養プレートにプレート化します。CAMで三次元腫瘍を生成するために、UM-SCC-1細胞の卵子あたり0.5〜1 x 10⁶細胞を計算します。細胞番号は細胞株によって異なる場合があることに注意してください。
2. 培地を吸引し、1% Pen/Strep と 10% FBS および 2.5 μg/mL の緑色蛍光色素を添加した DMEM 培地を添加します。細胞培養インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートします。次に、顕微鏡で蛍光強度を確認し、培地を吸引し、1X PBSで1回洗浄し、0.25%トリプシンを最大10分間添加します。DMEM添加培地でトリプシンを中和します。.
3. 250 x gで4分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。DMEM培地を吸引し、HBSSに再懸濁して余分な蛍光色素を洗浄します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
4. 卵を細胞培養層流キャビネットに運びます。はさみと鉗子で、卵を覆っている透明なフィルムドレッシングを開きます(図1E-F)。
5. 計算した細胞数を再度遠心分離し、HBSS培地を吸引し、同じ培地の5μLあたり⁶細胞の最終濃度0.5〜1×10で再懸濁します(図1G)。卵の総数に必要な量を準備します(卵子あたり5μLの細胞懸濁液)。
6. DRGから約2 mmのところにあるCAM上に5 μLのセル溶液を置きます(図1H)。DRGとセルの間の距離を一定に保ちます。細胞の拡散を最小限に抑えるために、卵子を邪魔しないように十分注意してください。
   手記：細胞移植を開始するには、CAM表面が視覚的に乾燥している卵子を選択します。表面が湿りすぎると、細胞が広がり、通常の腫瘍を形成しなくなります。
7. ステップ1.4のように、新しいフィルムドレッシングで卵を覆います。すべての卵子の細胞を移植します。卵を38°C、湿度54%の加湿インキュベーターで7日間、回転せずにインキュベートします。

結果

図1:DRG、細胞の移植、およびCAMの収穫:8日目:A。パラフィンワックス膜除去後のCAM観察が容易である。細い鉗子を使用して、DRGはCAM上に置かれます。卵をフィルムドレッシングで覆い、インキュベーターに入れます。矢印は覆われている開口部を指しています。10 日目: E-F。フィルムドレッシングが取り除かれ、DRGが配置されます(Fの矢印の先端)。 G-H.5 μL の細胞溶液を DRG から ~2 mm の距離で CAM に滴下します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
卵インキュベーター	GQFデジタルスポーツマン	#1502	自動回転子デジタルサーモスタット温度と湿度制御を備えた卵インキュベーター
彫刻カッター	ドレメル	#108	卵の殻をドリルで穴を開けるために使用されます
極細グレーフ鉗子、湾曲	ファインサイエンスツール(FST)	#11151から10	8日目にDRGをCAMに移植し、17日目にCAMtissueを採取するために使用されます
極細グレーフ鉗子、ストレート	ファインサイエンスツール(FST)	#11150から10	8日目にDRGをCAMに移植し、17日目にCAM組織を採取するために使用されます
受精ローマンホワイトレッグホーン卵			早期受精日に受精卵を受精させ、できれば受精後初日に行います。このプロトコルで使用される卵は、ミシガン州立大学の養鶏場からのものです。
フィルター鉗子	EMDミリポア	#XX6200006P	卵の殻を取り除くために使用される鈍い鉗子
HBSSの(1x)	ギブコ	#14025-092	ハンクのバランスの取れた塩溶液
パラフィンワックスメンブレン	パラフィルムラボラトリーフィルム	#PM-996	8日目にDRGが接ぎ木されるまで、卵の開口部を一時的に覆うために使用されます
PBS(1x)pH 7.4	ギブコ	#10010-023	リン酸緩衝生理食塩水
テガダーム透明フィルムドレッシング	3メートル	#9505W	滅菌済み、6x7cm、インキュベーション中に卵の開口部を覆うために使用されます