miRNA阻害剤による腫瘍内治療のモデリング:マウスモデルにおけるmiRNA阻害剤の腫瘍増殖への影響を分析する方法

要約

出典:Ramirez-Moya, J. et al.マウスの腫瘍増殖を減少させるためのマイクロRNAのin vivo阻害。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、同所性マウスモデルにおける腫瘍増殖に対する治療薬としてのmiRNA阻害剤のin vivo送達を示しています。合成miRNA阻害剤またはアンタゴmiRの腫瘍内投与により、内因性miRNAに結合して阻害することができ、それによってmRNAのアップレギュレーションと腫瘍増殖の抑制が引き起こされます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞の側面接種と腫瘍内拮抗薬治療

1. 細胞調製
   1. Cal62ヒト甲状腺がん細胞株(KRASG12Rおよびp53A161D変異)を操作して、GFPおよびルシフェラーゼ(CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP)を構成的に発現するトランスジェニックコンストラクトを過剰発現させます。トランスジェニック細胞は、抗生物質耐性によって、またはフローサイトメトリーでGFP陽性細胞を選別することによって選択します。
   2. ペニシリン、ストレプトマイシン、および10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)で細胞を37°Cおよび5%_CO2で増殖させます。
   3. 1 x 10⁶細胞を50 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4°Cで懸濁します。
2. マウスの脇腹への細胞接種
   1. 細胞を同量の基底膜マトリックスと混合します。例えば、50 μL の PBS に 1 x 10⁶ 個の細胞を 50 μL の基底膜マトリックス (材料の表を参照) に加え、穏やかに混合します。
   2. 100 μLのサンプル(PBS細胞+基底膜マトリックス)を、27G 1/2インチ(0.4x13 mm)針付きの1 mLインスリンシリンジを使用して、6週齢の免疫不全BALB/c nu/nuマウスの左側面に皮下注入します。
3. 腫瘍内アンタゴミR治療
   1. アンタゴmiR(材料表を参照)またはネガティブコントロールを500 μLのRNaseフリー蒸留水に懸濁します。
   2. 注射前に、2 nmolのアンタゴミールまたはコントロールを、各注射についてin vivo送達試薬(材料の表を参照)と一緒に調製します。
      1. まず、アンタゴmiR溶液(材料表を参照)と錯体化バッファー(材料表を参照)を1:1の比率で混合します。例えば、80 μL の miRNA 阻害剤溶液 (16 nmol) を 80 μL の錯化バッファー (in vivo 送達試薬キットに含まれています、材料表を参照) に加えます。
      2. in vivo導入試薬を室温に戻します。1.5 mLのチューブに160 μLを加え、すぐに160 μLの希釈したアンタゴミール溶液を加えます。残りの試薬を-20°Cに戻します。必要に応じて、試薬を4°Cで解凍後最大1週間保存してください。
      3. 直ちに(10秒)ボルテックスして、in vivo送達試薬-アンタゴミールの錯体形成を確保します。
      4. in vivo導入試薬-アンタゴミール混合物を50°Cで30分間インキュベートし、チューブを短時間遠心分離してサンプルを回収します。
      5. 1360 μLのPBS pH 7.4を加えて複合体を6倍に希釈し、よく混合します。
      6. 試薬-拮抗剤複合体(8匹/条件)のin vivo送達を続行するか、または複合体を4°Cで最大1週間保存してから注射してください。各腫瘍に200μLを腫瘍内に注入します(2 nmolのアンタゴミール).
         注:アンタゴミールの体積と量は、腫瘍の体積とは無関係です。
   3. 週3回(月曜日、水曜日、金曜日)2週間治療を行います。
4. 腫瘍増殖の解析
   1. D-ルシフェリン基質の40 mg/mL溶液(材料表を参照)を、27G 1/2インチ(0.4 mm x 13 mm)針付きの1 mLシリンジで各時点で皮下注入します。
      1. 注射後8分で、酸素と混合した3%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけます。ペダル反射(つま先をしっかりとつまむ)によって麻酔のレベルを評価し、必要に応じて麻酔薬の供給を調整して手術面を維持します。
      2. 乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗布します。.
5. in vivoイメージングソフトウェア(材料表参照)で生物発光シグナルをイメージングします
   注:キャリパーは、腫瘍の体積と腫瘍の成長を測定するためにも使用できます。
6. 生物発光シグナルが得られたら、両方の治療法を比較して腫瘍の成長を分析し、t検定を使用して有意性を判断します。グループ内分散を分析するには、SEMを使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
基底膜マトリックス:マトリゲル基底膜マトリックス高濃度	コーニング	#354248
AntagomiR:mirVana miRNA阻害剤	サーモフィッシャー	4464088	In vivo対応
In vivo導入試薬:Invivofectamine 3.0 Reagent	サーモフィッシャー	体外受精3005
ネガティブコントロール:mirVana miRNA Inhibitor, ネガティブコントロール #1	サーモフィッシャー	4464077	In vivo対応
XenoLight D-ルシフェリン - K+ 塩生物発光基質	パーキンエルマー	122799	PBSで希釈
In vivoイメージングソフトウェア:IVISLumina II Imaging System	キャリパーライフサイエンス