アガロースゲル液滴への3Dスフェロイドの埋め込み:ダウンストリーム分析のためのスフェロイド保存技術

要約

出典:Rolver, M. G. et al.がん細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価。J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、アガロースゲル液に3Dスフェロイドを埋め込んで保存する技術について説明しています。埋め込まれた3Dスフェロイドは、さらに下流の解析に使用できます。

プロトコル

1. 3D回転楕円体の埋め込み

1. スフェロイドが埋め込まれているアガロースゲルを調製します(プロトコールを初めて実行する場合のみ必要)
   1. 1 gのバクト寒天を50 mLのddH₂Oに混ぜます。
   2. バクト寒天が溶解し、均一なゲルが形成されるまで、電子レンジでゆっくりと加熱します。ゲルを沸騰させないでください。
   3. バクト寒天を60°Cの水浴で温めてください。
   4. 実験の合間は4°Cに保ちます。
2. スフェロイドの埋め込み
   1. 1日目に、各状態について、1.5mLチューブに最低12個のスフェロイドをプールします。
   2. 氷冷した1X PBS1 mLで1回洗浄します。
   3. スフェロイドを固定するには、4% パラホルムアルデヒド 1 mL を加えます.
      手記：パラホルムアルデヒドの取り扱いは、ドラフト内で行う必要があります。
   4. RTで24時間インキュベートさせます。
   5. 2日目は、アガロースゲルを電子レンジの水入りビーカーに入れて慎重に加熱します。ゲルが沸騰しないようにしてください。ベンチトップの加熱プレートで、使用するまで60°Cで保温してください。
   6. スフェロイドを氷冷した1X PBS1 mLで2回洗浄します。
   7. 1X PBSの大部分を吸引します(この時点で約100 μLを残すと、スフェロイドの取り扱いに実用的です)。
   8. ピペットの先端を傾斜させて切断し、より大きな穴のある先端を得ることにより、20μLのピペットを準備します(図1).
      注:次の部分は、最適なスフェロイド転写を確保し、ゲル滴の固化を避けるために迅速に行う必要があります。加熱ブロックが利用できない場合は、最初にスフェロイドを捕まえてからアガロースを落下させることをお勧めします(つまり、ポイント1.2.9と1.2.10の順序を入れ替えます)。
   9. 顕微鏡スライド上にアガロースゲルを滴下します。アガロースが固まらないように、スライドを温かい加熱ブロックに置きます。
   10. 改良したピペットチップ(ステップ1.2.8)を使用して、15〜20 μLの容量でできるだけ多くのスフェロイドを捕捉します。
   11. 顕微鏡スライドに触れずに、15–20 μLのスフェロイド含有1X PBSをアガロースゲル液滴の中心に慎重に注入します><。 手記：これはちょっと難しい点です。スフェロイドをゲル滴に注入する際にピペットの先端が顕微鏡スライドに触れると、スフェロイドが失われます。アガロース液滴を作成し、スフェロイドを注入するプロセス全体を、液滴に着色された液体を注入して練習することをお勧めします。これにより、色付きの液体がスライドに漏れるため、液滴への潜在的な浸透を視覚化できます。
   12. アガロースゲル液滴を室温または4°Cで5〜10分間インキュベートして硬化させます。ゲル滴がいくらか固まったら(ただし、まだかなり柔らかい)、顕微鏡スライドからゲル滴をメスでプラスチック製のティッシュカセットに慎重に押し込みます。
   13. プラスチックティッシュカセットを70%エタノールで覆います.
       手記：この時点で、スフェロイドは直接使用することも、数か月間保存することもできます。
   14. アガロース包埋スフェロイドをパラフィンに包埋し、厚さ2〜3 μmのスライドに切片化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色するか、免疫組織学的染色を行います。

結果

図1:スフェロイドの固定、包埋、および免疫組織化学解析 (A)スフェロイドの包埋のためのプロトコルの概略図。個々のステップには(i-vii)のマークが付けられています。(B)MDA-MB-231スフェロイドが埋め込まれた画像。スケールバー:50μm.(C)化学療法治療を受けたMDA-MB-231スフェロイドをp-53に対する抗体を用いてIHC分析した代表的な画像。破線は回転楕円体の円周を示しています。スケールバー = 20 μm. (D, E) DMSOまたは化学療法で治療された(それぞれ上パネルと下パネル)MDA-MB-231スフェロイドの代表的な画像。MDA-MB-231細胞を超低接着96ウェルプレー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バクトアガル	BDバイオサイエンス	#214010	アガロースゲル調製に使用
ホルムアルデヒド	VWRケミカルズ	#9713.1000	細胞固定に使用
Medim Uni-safeカセット	Medim Histotechnologie	〒10-0114	埋め込みスフェロイドの保管に使用
スーパーフロスト ウルトラプラス 接着スライド	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	埋め込みに用いる顕微鏡用スライドガラス
CellTiter-Glo 3D細胞生存率アッセイ	プロメガ	#G9681	細胞生存率アッセイに使用