マウスモデルからの細胞外マトリックスの作製:マウス舌から脱細胞化舌細胞外マトリックスを調製するための効果的な手順

要約

出典:Yao, Y. et al.舌細胞外マトリックスの作製と舌扁平上皮癌のin vitroでの再構成。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、採取した舌を一連の物理的、化学的、および酵素的処理にさらす脱細胞化法を使用して、マウスの舌細胞外マトリックスを調製する方法を示しています。得られたTEMスキャフォールドは、本来の細胞外マトリックス組成を保持し、細胞成分を除去します。

プロトコル

動物が関わるすべての手続きは、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 舌細胞外マトリックス(TEM)の調製

1. 頸部脱臼によってマウスを処刑し、滅菌手術用ハサミとピンセットを使用して舌を切除します。
2. 舌を75%エタノールに3分間浸し、その後、各舌を10 mM滅菌リン酸緩衝溶液(PBS)1 mLを入れた1.5 mLのエッペンドルフ(EP)チューブに入れます
   手記：後続のすべてのステップでのPBSの濃度は、このステップの濃度と同じです。
3. 凍結融解による細胞溶解:EPチューブ内の舌を-80°Cで1時間凍結し、その後、舌を室温で45分間3サイクル
解凍します。
4. 外科用針を使用して各舌を外科用縫合糸にロードし、縫合糸の端を滅菌ティンフォイルの小片で包みます。75%エタノールを含む3.5cmまたは6cmの培養皿で無菌状態で操作を行います
   手記：外科用縫合糸の各ピースの適切な長さは約20cmであり、ティンフォイルの各ピースの適切なサイズは約0.3cm2(1cm×0.3cm)です。舌はティンフォイルの近くにロードする必要があります。
5. 3.5 cmまたは6 cmの培養皿で各舌を3 mLの滅菌PBSで30秒間すすぎます。この操作は滅菌条件で行ってください。
6. 超純水で舌を洗う:アンピシリンを250 mLの滅菌超純水を入れた広口ボトルに、最終濃度90 μg / mLまで加えます。.攪拌棒の入ったボトルに舌を入れます。縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でボトルキャップを締めます。この操作は無菌状態で行ってください。
   手記：縫合糸の絡み合いを考慮し、同じボトルに最大5本の舌を入れることができます。アルミホイルはボトル内の縫合糸の端にあり、舌が滑り落ちるのを防ぎます。舌は、ボトル内に残っている縫合糸の長さを調整して、ボトルの底から2cmの高さに配置する必要があります。このノートは、ステップ 1.8、1.10、1.12、および 1.16 にも記載されています。
7. ボトルをマグネチックスターラーに12時間置きます。
8. NaClで舌を洗浄する:アンピシリンを250 mLの滅菌1 M NaClとともに広口ボトルに加え、最終濃度90 μg/mLにします。舌と攪拌棒をボトルに移します。縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でボトルキャップを締めます。この操作は無菌状態で行ってください。
9. ボトルをマグネチックスターラーに24時間置きます。
10. Triton X-100による細胞溶解:PBS中の滅菌2% Triton X-100 250 mLを入れた広口ボトルに、最終濃度90 μg/mLのアンピシリンを加えます。舌と攪拌棒をボトルに移します。縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でボトルキャップを締めます。この操作は無菌状態で行ってください。
11. ボトルをマグネチックスターラーに48時間置きます。
12. CaCl₂/MgCl₂で舌を洗浄する:250 mLの滅菌済み5 mM CaCl₂/MgCl₂を入れた広口ボトルにアンピシリンを最終濃度90 μg/mLまで加えます。舌と攪拌棒をボトルに移します。縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でボトルキャップを締めます。この操作は無菌状態で行ってください。
13. ボトルをマグネチックスターラーに24時間置きます。
14. DNaseによる消化:各EPチューブに1 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)を加えます。DNaseをHBSSにそれぞれ最終濃度300μMまで追加し、各舌を各EPチューブに移動し、縫合糸の一部をチューブの外側に置きます。この操作は無菌状態で行ってください。
    手記：前のステップでボトルの内側に残っている縫合糸の部分が、このステップではEPチューブの内側にも残っていることを確認し、前のステップでボトルの外側に残っている縫合糸の部分も、このステップではEPチューブの外側に残っていることを確認してください。
15. EPチューブ内の舌を37°Cで24時間インキュベートします。
16. PBSで舌を洗う:アンピシリンを250 mLの滅菌PBSを入れた広口ボトルに、最終濃度90 μg / mLまで加えます。.舌と攪拌棒をボトルに移します。縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でボトルキャップを締めます。この操作は無菌状態で行ってください。
17. ボトルをマグネチックスターラーに24時間置きます。
18. 調製したTEMは、使用するまで滅菌PBSに4°Cで保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57-BL/6Jマウス	中山大学実験動物センター
エタノール	広州化学試薬工場	HB15-GR-2.5L
塩化ナトリウム	サンゴンバイオテック	A501218
二塩基性リン酸ナトリウム	広州化学試薬工場	BE14-GR-500グラム
リン酸カリウム一塩基性	サンゴンバイオテック	A501211
1.5 mL EPチューブ	アクシゲン	MCT-150-Aシリーズ
超低温冷凍庫	サーモフィッシャーサイエンティフィック
3.5cm細胞培養皿	サーモフィッシャーサイエンティフィック	153066
6cm細胞培養皿	グライナー	628160
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	V900502
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	746495
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	449164
DNase	シグマ・アルドリッチ	D5025
アンピシリン	シグマ・アルドリッチ	A9393
外科用縫合糸	上海金環
250mL広口ボトル	シュニウ	1407
マグネチックシェーカー	一つとして	1-4602-32
二酸化炭素インキュベーター	シェルラボ	SCO5Aの
浄水 器	エルガ
ヘプスフリー酸	BBIの	A600264
4°C冷蔵庫	ハイアール