方法論記事

脱細胞化組織のクライオミリング:微細な細胞外マトリックス粉末を得る技術

2023年4月30日

この記事について

要約

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出典:Kornmuller, A. et al.組織特異的細胞培養および送達プラットフォームとしての細胞外マトリックス由来フォームおよびマイクロキャリアの作製。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、凍結乾燥脱細胞化組織から細かく粉砕した細胞外マトリックス粉末をクライオミリングにより得るためのプロトコールを紹介します。粉末化されたECMは、その生化学的組成を保持し、マイクロキャリア合成に使用できます。

プロトコル

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1. 脱細胞化組織プロセッシング

  1. 脱細胞化と凍結乾燥
    1. 確立されたプロトコルに従って目的の組織を脱細胞化します.
      手記：現在の研究の足場は、ヒトDAT、ブタDDT、およびブタDLVの公開された脱細胞化プロトコルに従って調製されています。市販の不溶性コラーゲンは、10〜50 mg/mLの濃度範囲で成功裏に使用されているウシ腱由来のコラーゲンなどのフォームやマイクロキャリアの製造にも使用できます。他の不溶性コラーゲン源を利用することもできますが、安定した足場を生み出す濃度範囲を特定するために最適化が必要な場合があります。
    2. 水和した脱細胞化組織または精製コラーゲンを鉗子付きの50 mL遠心チューブに移し、十分な二重蒸留水(ddH₂O)を加えて組織を浸し、最大総容量35 mLにします。
    3. サンプルを-80°Cで一晩凍結し、凍結中は遠心分離管を水平に配置して、その後の凍結乾燥時の昇華のための表面積を最大化します。
    4. 遠心分離チューブからキャップを取り外し、凍結したサンプルを凍結乾燥ジャーに移します。
    5. 実験室の凍結乾燥機を使用して、サンプルを48〜72時間、または完全に乾燥するまで凍結乾燥します.
      手記：乾燥時間は、凍結乾燥機や脱細胞組織によって異なる場合があります。
    6. 凍結乾燥したECMを鋭利な手術用ハサミで細かく刻みます(~1〜2 mm3)。
    7. ミンチしたECMは、次の処理の準備ができるまでデシケーターに保管します。
      手記：環境からの吸湿を防ぐために、刻んだECMをすぐに使用することをお勧めします。
  2. クライオミリング(発泡スチロール製造のオプション)
    1. 実験室用ボールミルシステム用の25 mLステンレス製フライスチャンバーに、みじん切りにした凍結乾燥ECMを充填し、10 mmステンレス製フライスボールを2個追加します。
    2. ロードしたフライスチャンバーを閉じて、液体窒素に3分間完全に沈めます。
    3. 凍結したサンプルを30Hz(1,800rpm)で3分間粉砕します。
    4. ECMが微粉末に粉砕されるまで、手順1.2.2と1.2.3を繰り返します
      手記：これらの手順を繰り返す回数は、ECM ソースによって異なる場合があります。たとえば、DATは通常、微粉末を生成するために3回の粉砕サイクルを必要とします。
    5. スクーピュラを使用して粉末をガラスバイアルに移し、しっかりと密封して、デシケーターで保管します。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ワニ口クリップリード線VWRの470149から728
アルミホイルフィッシャーサイエンティフィック01-213-101
分析天びんザルトリウスCPA225D
クライオミリングシステムレッチ20.745.0001ミリMM 400
デシケーターフィッシャーサイエンティフィック8624426凍結乾燥ECMおよびバイオスキャフォールド保存用
デュワーフラスコフィッシャーサイエンティフィック10.196-6低容量型、容量範囲は 250 - 500 mL
二重蒸留水(ddH2O)Barnstead GenPure xCAD純水製造システムより
ECM(細胞外マトリックス)ヒト脂肪組織、ブタ真皮またはブタ心筋から単離(Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010)
鉗子VWRの37-501-32フォームの転写用
フリーザー(-20°C)VWRの97043-346
冷凍庫(-80°C)サーモサイエンティフィックEXF40086A
ガラスバイアルフィッシャーサイエンティフィック03-339-26D凍結乾燥クライオミルドECMの保存
液体窒素エレクトロスプレー用
凍結乾燥機ラブコンコ7750021フリーゾーン4.5
フライスチャンバーレッチ02.462.021325 mLの容量を推奨
フライスボールVWRの16003-606直径10 mm、ステンレス鋼を推奨
ペニシリン-ストレプトマイシンライフテクノロジー15140-122増殖培地に使用
ピペットエイドXPマンデルサイエンティフィックDRU-4-000-101
スクープーラVWRの89259から968マイクロキャリアの収集に
手術用ハサミVWRの82027-590
(代表)

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タグ

ECM

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