ECM懸濁液調製:組織由来細胞外マトリックスから均質な懸濁液を得る技術

要約

出典:Kornmuller, A. et al. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、脱細胞化および凍結乾燥組織から均質化および消化された細胞外マトリックス懸濁液の調製について説明しています。この技術は、高度な3D細胞培養モデルの基質として使用するためのECM由来の多孔質フォームとマイクロキャリアの製造に役立ちます。

プロトコル

1. 脱細胞化組織プロセッシング

1. 脱細胞化と凍結乾燥
   1. 確立されたプロトコルに従って目的の組織を脱細胞化します.
      手記：現在の研究の足場は、ヒト脱細胞化脂肪組織(DAT)、ブタ脱細胞化真皮組織(DDT)、およびブタ脱細胞化左心室(DLV)の公開された脱細胞化プロトコルに従って調製されています。市販の不溶性コラーゲンは、10〜50 mg/mLの濃度範囲で成功裏に使用されているウシ腱由来のコラーゲンなどのフォームやマイクロキャリアの製造にも使用できます。他の不溶性コラーゲン源を利用することもできますが、安定した足場を生み出す濃度範囲を特定するために最適化が必要な場合があります。
   2. 水和した脱細胞化組織または精製コラーゲンを鉗子付きの50 mL遠心チューブに移し、十分な二重蒸留水(ddH₂O)を加えて組織を浸し、最大総容量35 mLにします。
   3. サンプルを-80°Cで一晩凍結し、凍結中は遠心分離管を水平に配置して、その後の凍結乾燥時の昇華のための表面積を最大化します。
   4. 遠心分離チューブからキャップを取り外し、凍結したサンプルを凍結乾燥ジャーに移します。
   5. 実験室の凍結乾燥機を使用して、サンプルを48〜72時間、または完全に乾燥するまで凍結乾燥します.
      手記：乾燥時間は、凍結乾燥機や脱細胞組織によって異なる場合があります。
   6. 凍結乾燥したECMを鋭利な手術用ハサミで細かく刻み(~1〜2 mm³)します。
   7. ミンチしたECMは、次の処理の準備ができるまでデシケーターに保管します。
      手記：環境からの吸湿を防ぐために、刻んだECMをすぐに使用することをお勧めします。
2. クライオミリング
   1. 実験室用ボールミルシステム用の25 mLステンレス製フライスチャンバーに、みじん切りにした凍結乾燥ECMを充填し、10 mmステンレス製フライスボールを2個追加します。
   2. ロードしたフライスチャンバーを閉じて、液体窒素に3分間完全に沈めます。
   3. 凍結したサンプルを30 Hz(1,800 rpm)で3分間粉砕し、微粉末にします。
      手記：これらの手順を繰り返す回数は、ECM ソースによって異なる場合があります。たとえば、DATは通常、微粉末を生成するために3回の粉砕サイクルを必要とします。
3. ECM懸濁液の準備
   1. 250 mgのミンチECM(フォーム用)またはクライオミル(フォームまたはマイクロキャリア用)のECMを秤量し、15 mLの遠心チューブに移します。ミンチECMとクライオミルECMの調製については、それぞれステップ1.1.6とセクション1.2を参照してください
      手記：このプロトコールは、ヒトDAT、ブタDDT、およびブタDLVに推奨される50 mg/mL ECM懸濁液を調製するように設計されています。特定のECMソースに応じて、開始濃度が高い場合も低い場合も均一な懸濁液が生成される場合があります。
   2. 5 mLの0.22 M NaH₂PO₄(pH 5.4)緩衝液を遠心チューブに加え、チューブの液面に印を付けます。
   3. α-アミラーゼストック溶液を調製するには、7.5 mgのα-アミラーゼを1 mLの0.22 M NaH₂PO₄(pH 5.4)緩衝液に添加します。α-アミラーゼストック溶液100μL(α-アミラーゼ0.75mg:乾燥組織0.3%w/w)をサンプルに加えます。0.22 M NaH₂PO₄を添加して、最終容量10 mLを得ます。
   4. 懸濁液を室温で300rpmで72時間連続的に撹拌します。
   5. 懸濁液を1,500 x gで10分間遠心分離し、消化されたECMペレットを乱さずに上清を慎重に収集して廃棄します。ペレット化した材料を、ddH₂Oで希釈した5% NaCl 10 mLに再懸濁します。
   6. ステップ1.3.5を繰り返して、ddH₂O中の5% NaClで合計2回のすすぎを行います。
   7. 上清を捨て、ペレット状物質を10mLの_ddH2Oに再懸濁します。
   8. 懸濁液を300rpmでRTで10分間連続的に撹拌します。
   9. 懸濁液を1,500 x gで10分間遠心分離し、消化されたECMペレットを乱さずに上清を慎重に収集して廃棄します。
   10. ステップ 1.3.2 で作成した 5 mL のマークに 0.2 M 酢酸を加えます。
   11. 懸濁液を120 rpm O / N、37°Cで連続的に撹拌します。
   12. 幅10 mmの鋸歯状プローブを装備したハンドヘルドホモジナイザーを使用して、ECM懸濁液を室温で10秒間隔でホモジナイズします。過熱を防ぐために、均質化間隔の間に懸濁液を冷水のビーカーに入れます。
       手記：ECMの供給源によっては、均質な懸濁液を得るために、0.2 M酢酸でさらに希釈する必要がある場合があります。ECM懸濁液を過度に冷却すると、粘度が上昇し、効率的な均質化が妨げられる可能性があります。粘度の上昇が認められた場合は、サンプルを37°Cに再加温し、さらに処理することができます。
   13. フォームまたはマイクロキャリアの製造前に、4°Cで最大1か月間保管してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸、氷河	バイオショップ	ACE222.5
α-アミラーゼ	シグマ	101074694	Aspergillus aryzaeから
遠心分離機75004251	サーモサイエンティフィック		15 mL & 50 mL 遠心分離チューブ用のスイングバケットローター付き
遠心分離チューブ(15 mL)	ザルシュテット	62.554.205
デシケーター	フィッシャーサイエンティフィック	8624426	凍結乾燥ECMおよびバイオスキャフォールド保存用
二重蒸留水(ddH2O)			Barnstead GenPure xCAD純水製造システムより
ECM(細胞外マトリックス)			Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)に記載されているように、ヒト脂肪組織、ブタ真皮またはブタ心筋から単離
ハンドヘルドホモジナイザー	フィッシャーサイエンティフィック	14-359-251	回転数: 8,000 - 30,000 rpm
ホモジナイザーアクセサリー:鋸歯底ジェネレータープローブ	フィッシャーサイエンティフィック	14*261*17	10 x 95
液体窒素
塩化ナトリウム	バイオショップ	〒7647*14-5
リン酸ナトリウム一塩基性	バイオショップ	10049*21*5
手術用ハサミ	VWRの	82027-590

ミリメートル