凍結乾燥による細胞外マトリックス由来泡の作製:脱細胞化組織のECMから生物学的足場を生成する手順

要約

出典: Kornmuller, A. et al. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、化学架橋を必要とせずに純粋なECM由来の泡を合成する方法を説明しています。これらのECM由来のフォームは、高度な3D in vitro細胞培養モデルとして、または再生を促進するバイオスキャフォールドとして応用されています。

プロトコル

>1. ECM由来の発泡スチロール製造

1. ECM微粉末を緩衝液に分散させて均質なECM懸濁液を調製し、懸濁液が温まるまで120rpmで連続的に撹拌しながら37°Cでインキュベー
トします。
2. ECM懸濁液を0.2 M酢酸で所望の濃度に希釈します
   手記：ECMの供給源にもよりますが、安定なフォームは10〜100 mg/mLの範囲で調製でき、DAT、DDT、およびDLVの推奨範囲は15〜50 mg/mLです。通常、高濃度で製造されたフォームは、多孔質がわずかに少なくなりますが、培養の安定性が高く、取り扱いが容易です。
3. ECM懸濁液に気泡が形成されるのを防ぐために、18G針付きの3mLシリンジを使用して、目的の型にECM懸濁液を充填します。DAT、DDT、およびDLVフォームを作製するには、400 μLの35 mg/mL ECM懸濁液を48ウェル細胞培養処理プレートに分注します><。 手記： 選択した金型の形状とECMサスペンションの体積によって、得られるフォームの形状が決まります。
4. 型を覆い、-20°Cまたは-80°Cの冷凍庫に入れて一晩冷凍します
   手記：凍結温度は、フォームの多孔性に影響を与える可能性があります。サンプルを-20°Cで凍結すると、-80°Cと比較して、より大きな氷の結晶が形成されるため、より大きな細孔が予想されます。均一な多孔質構造のフォームを製造するには、傾斜冷却を防ぐために、金型が導電性表面と接触していないことを確認してください。
5. 凍結したサンプルを入れた型を凍結乾燥機のフラスコに入れます。凍結乾燥機フラスコを実験室の凍結乾燥機システムに接続し、24時間乾燥させます
   注:凍結乾燥前にサンプルを凍結しておくことが重要です。
6. 凍結乾燥フォームは、必要になるまで乾燥剤で保管してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
分析天びん	ザルトリウス	CPA225D
遠心分離チューブ(15 mL)	ザルシュテット	62.554.205
遠心分離チューブ(50mL)	ザルシュテット	62.547.205
ウシアキレス腱由来コラーゲン 腱(不溶性)	シグマ	C9879	または同様の不溶性コラーゲン 源;an として使用できます 脱細胞化 の代替 フォームを製造するための組織と マイクロキャリア
デシケーター	フィッシャーサイエンティフィック	8624426	凍結乾燥ECMおよび 用 バイオスキャフォールドストレージ
デュワーフラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	10.196-6	低形態、容量範囲は250-500mL
二重蒸留水(ddH_{2} O)			Barnstead GenPure xCAD より 浄水システム
D-PBS(リン酸緩衝液 生理食塩水)	ヨーロッパバイソン	311425125
ECM(細胞外マトリックス)			ヒト脂肪から単離 ティッシュ、ブタ真皮またはブタ Flynn に記載されている心筋 et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
鉗子	VWRの	37-501-32	フォームの転写用
フリーザー(-20°C)	VWRの	97043-346
冷凍庫(-80°C)	サーモサイエンティフィック	EXF40086A
ガラスバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-339-26D	凍結乾燥されたクライオミルドの保存 ECM
液体窒素			エレクトロスプレー用
凍結乾燥機	ラブコンコ	7750021	フリーゾーン4.5
18G針	VWRの	C ABD305185	ECM懸濁液の分注用 型に
オービタルインキュベーターシェーカー	サイロテックス	832010089999	温度制御(37°C)
血清ピペット(10 mL)	ザルシュテット	86.1254.001
血清ピペット(25 mL)	ザルシュテット	86.1685.001
塩化ナトリウム	バイオショップ	〒7647*14-5
リン酸ナトリウム一塩基性	バイオショップ	10049*21*5

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