エレクトロスプレーによるバイオスキャフォールド作製:脱細胞化組織の細胞外マトリックス由来のマイクロキャリアスキャフォールド作製技術

要約

出典:Kornmuller, A. et al. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、エレクトロスプレーによる細胞外マトリックス由来のマイクロキャリア作製手順を実演しています。これらのマイクロキャリアは、天然の組織特異的微小環境をシミュレートし、長期の3D in vitro細胞培養モデルで安定しています。

プロトコル

1. エレクトロスプレー法によるECM由来マイクロキャリア作製

>注:エレクトロスプレーのセットアップの概要を図1に示します。

1. あらかじめ調製したクライオミルECM懸濁液を37°Cでインキュベートし、100 rpm O/Nで連続的に攪拌します。
   手記：クライオミルドECMは、ECM由来のマイクロキャリアを製造するために使用され、懸濁液の均一性を高め、エレクトロスプレー中の目詰まりを防ぎます。
2. 3 mL の ECM 懸濁液を 3 mL の Luer-Lock シリンジにロードし、シリンジの口径にウィングドインフュージョンセットを取り付けます。
   手記：さまざまなニードルゲージを使用することができますが、その選択が結果として得られるマイクロキャリアのサイズと形状に影響を与える可能性があることを認識しています。DAT、DDT、およびDLVマイクロキャリアを作製するには、25Gニードルを使用します。
3. シリンジをシリンジポンプ内に固定します。針をレトルトスタンドに固定し、針先を低形状のデュワーフラスコの上部から4〜6 cmの距離に垂直に配置します(250〜500 mLのサイズ範囲を推奨)。
4. 針の先端にワニ口クリップ電極を取り付け、高圧電源のプラス端子に接続します。
5. アルミホイルのストリップ(12 x 5 cm)を魔法瓶の端に折ります。
6. 2番目のワニ口クリップ電極をホイルの外縁に取り付け、電源の接地源端子に接続します。
7. デュワーフラスコを上部から約1cmまで液体窒素で満たし、ホイルの3/4が水没するようにします
   手記：デュワーフラスコを液体窒素で満たしておくことが重要です。液体窒素の表面は、エレクトロスプレープロセス中にフラスコの上部から2cm以上離れてはなりません。エレクトロスプレー中に液体窒素を一定に保つためには、液体窒素の連続的な補充が必要です。
8. シリンジポンプを30 mL / hの注入速度に設定します。
   手記：注入速度を変えると、マイクロキャリアの形状と直径が変わる可能性がありますが、推奨される範囲は25〜35 mL/hです。懸濁液の粘度に大きく依存しますが、流速が25 mL/h未満になると、より大きなマイクロキャリアが生成される可能性があります。非常に低い流量では、マイクロキャリアのサイズと形状が不均一になる可能性があります。35 mL/hを超える注入速度では、エレクトロスプレーによって生成された液滴の均一性が乱され、サイズ分布が広い非球状マイクロキャリアが生じる可能性があります。
9. 20 kVの電圧を印加し、シリンジポンプをオンにしてエレクトロスプレーを開始します。
   手記：電圧は、マイクロキャリアのサイズを調整するために変化させることができ、注入速度よりも直径に大きな影響を与える傾向があります。推奨される電圧範囲は 15 〜 25 kV です。電圧の増加に伴い、マイクロキャリアの直径が小さくなることが予想されます。
10. 注入が完了したら、デュワーから余分な液体窒素を慎重に注ぎ出し、マイクロキャリアを~25 mLの液体窒素に懸濁させて凍結したままにします。
11. 液体窒素を入れたマイクロキャリアを、1回の滑らかな動きで注ぐことにより、すぐに50mLの遠心分離チューブに移します。デュワーに残っている凍結したマイクロキャリアをスクーピュラで集め、遠心分離チューブに追加します。
    手記：デュワーのサイズにもよりますが、液体窒素中のマイクロキャリアを最初に中型の容器に注ぎ、その後すぐに50mLの遠心分離チューブに移すことができます。
12. 液体窒素中のマイクロキャリアを含む遠心分離管を、凍結乾燥の準備として小さな穴を開けたアルミホイルで覆います。
13. 蓋をした遠心分離チューブを凍結乾燥機のフラスコに入れます。すぐにフラスコを凍結乾燥機に接続し、サンプルO/N.
    を乾燥させます 手記：マイクロキャリアを液体窒素に懸濁させておくことは、このステップの前にマイクロキャリアが解凍されないようにすることが非常に重要です。上記のエレクトロスプレー条件を使用して35 mg/mLの濃度で作製されたDAT、DDT、およびDLVマイクロキャリアは、通常、350〜500 μmのサイズの水和直径を持ちます。サイズ分布は、ECM ソースによって異なる場合があります。
14. 凍結乾燥されたマイクロキャリアは、必要になるまでデシケーターに保管してください。

結果

図 1.マイクロキャリア製造に使用されるエレクトロスプレー装置の概要。A:シリンジポンプや高電圧電源などの主要なエレクトロスプレー装置の配置と、液体窒素のデュワーに対する針の位置を示す画像。B:電圧、注入速度、 そして距離。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ワニ口クリップリード線	VWRの	470149から728
アルミホイル	フィッシャーサイエンティフィック	01-213-101
遠心分離チューブ(15 mL)	ザルシュテット	62.554.205
遠心分離チューブ(50mL)	ザルシュテット	62.547.205
デシケーター	フィッシャーサイエンティフィック	8624426	凍結乾燥ECMおよびバイオスキャフォールド保存用
デュワーフラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	10.196-6	低容量型、容量範囲は 250 - 500 mL
ECM(細胞外マトリックス)			Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)に記載されているように、ヒト脂肪組織、ブタ真皮またはブタ心筋から単離
液体窒素			エレクトロスプレー用
凍結乾燥機	ラブコンコ	7750021	フリーゾーン4.5
オービタルインキュベーターシェーカー	サイロテックス	8.3201E+11	温度制御(37°C)
レトルトスタンド	VWRの	470019から526
レトルトスタンドクランプ	VWRの	21573-606
Safety-Lokシリンジ	BDの	309606	3 mL ルアーロックシリンジ(マイクロキャリア製造およびECM懸濁液分注用
スクープーラ	VWRの	89259から968	マイクロキャリアの収集に
シリンジポンプ	VWRの	10117-490	マイクロプロセッサ制御
高圧電源	ガンマ高電圧研究	ES30P-5W/DDPMシリーズ	推奨15 - 25 kVの電圧範囲に対応
翼のある輸液セット	テルモ	22258092	チューブの長さは30cm、推奨は25 G 3/4インチ。他のニードルゲージも使用でき、マイクロキャリアの直径に影響を与える可能性があります