マウス背根神経節とがん細胞の三次元共培養モデルの確立:神経周囲がん細胞の浸潤を研究するためのインビトロモデル

要約

出典:Huyett, P. et al.頭頸部扁平上皮癌における神経周囲浸潤のモデル。J. Vis. Exp.(2017年)

この動画では、マウスの後根神経節と神経向性がん細胞を共培養することで、in vitroの神経周囲がん細胞浸潤モデルを開発する手順を実演します。このモデルは、がんアッセイの実施に利用でき、迅速で再現性のある結果を得ることができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 半固体マトリックス液滴の調製 (< 1 プレートあたり 1 分)

1. 手術用顕微鏡の下の氷のブロックの上に、事前に冷却したガラス製のウェルボトムプレートを置きます。マトリックスのアリコートが常に氷上に残っていることを確認してください。
2. 2 μLまたは10 μLのマイクロピペッターを使用して、ガラス底板の4つの角のそれぞれに1.5 μLのマトリックス液滴を置き、ガラスウェルの端から液滴自体と少なくとも同じ距離を残します。
   1. ピペットの先端を45度の角度でグラスに直接置きます。マトリックスをゆっくりとピペットで動かします。マトリックスがプレートにかみ合った後、ガラスの底からゆっくりと離れます.
      手記：マトリックスとガラスの間の表面張力は、毎回完全な半球を作り出す必要があります。
   2. チップが空になる直前にピペッティングを停止してください。これは、マトリックス液滴に誤って空気を注入すると、マトリックス液滴の直径がはるかに大きくなり、除去が困難になるためです。
      手記：セカンドハンドを使用してピペッティングハンドを安定させることで、より正確な配置が容易になります。

2. DRGの半固体マトリックス液滴への挿入(プレートあたり<2分)

1. マトリックス液滴をプレートに含ませたプレートを室温(~1分)で短時間放置します。これにより、マトリックスがわずかに硬くなり、DRGの正確な配置が容易になります。
2. 左手で閉じた顕微鏡鉗子でDRGをそっとすくい取ります(つかまないでください)。ここでも、小さな白いDRGに対して暗い背景が視覚化を容易にします。DRGを右手の21G針の先端に移します。この転送により、鉗子に残留媒体が残ります。
3. 21G針を使用して、DRGをマトリックス液滴の中央にゆっくりと挿入します(図1)。ほとんどの場合、DRGは簡単にマトリックスに放出され、針で中央に配置できます。
   1. DRGが針にくっついている場合は、顕微鏡の鉗子を使用してDRGを針からマトリックス液滴に押し出します。ラボワイプで顕微鏡の鉗子から余分な媒体を吸い取ります。
      手記：マトリックスに培地を導入すると、アッセイの直径、容量、および一貫性が変化します。色付きまたは色付きの文字のアイスブロックは、背景のコントラストを提供し、この繊細なプロセスの視覚化を容易にします。
4. プレートに 4 つの DRG がすべて揃ったら、最終検査を実行して、DRG がマトリックス液滴の中心にあることを確認します。必要に応じて21Gニードルで調整します。
5. 完成したプレートを37°Cのインキュベーターに移します。これにより、半固体マトリックスが固化し、DRGが所定の位置に固定されます。
6. すべてのDRGに対してこのプロセスを繰り返します。ネガティブコントロールとして、DRGのない空白のマトリックス液滴を配置します。
7. すべてのプレートが完成し、37°Cインキュベーターに少なくとも3分間さらされた後、各ガラス底プレートに10%FBS培地を含む4 mLのDMEMを加えます。プレートをわずかな角度で置き、培地をゆっくりと加えます。マトリックスDRGユニットと徐々に接触するようにします。
   手記：培地の添加が速すぎたり、激しく加えたりすると、マトリックスやDRGが外れる可能性があります。
8. アッセイを37°Cインキュベーターに保管し、次の48–72時間用
   手記： アッセイの定期的な検査では、マトリックスエッジに向かって神経突起の円周方向の伸長が見られます(図2)。神経突起がマトリックスまでの道のりの4分の3より大きい場合、細胞をプレートするのが適切です。

3. 頭頸部がん細胞の調製

>注:この実験デザインでは、頭頸部扁平上皮癌細胞以外の細胞株を使用できます。

1. 扁平上皮がん細胞株をDMEMで10% FBS含有し、37°Cインキュベーター内のお好みのフラスコまたは培養皿で維持します。実験用の細胞を準備するには、培養フラスコまたは皿からすべての培地を吸引し、PBSで2回洗浄します。適量の0.025%トリプシンを5分間添加して細胞を懸濁し、続いてDMEMと10%FBSを添加します。細胞と培地の混合物4 mLを6 mLの培養皿にピペットで移します。
   手記：6 mLの培養プレートは、コンフルエントが50%未満の場合でも、十分な細胞を提供します。
2. DRGアッセイで染色およびプレーティングする24時間前に、HNSCC細胞株をさまざまな条件にさらします。細胞がプレーティングされたら、一貫した環境を維持するために条件を再投与します.
   手記： マウスを解剖し、DRGをマトリックスに移植してから1〜2日後に、抗体、成長因子、サイトカイン、またはその他の分子を細胞培養皿に添加します。
3. 細胞をプレーティングする1時間前(DRGハーベストおよびマトリックスへの移植の2〜3日後)に蛍光細胞染色液を添加します。
   手記：ここで使用されている特定の染色は、細胞膜を自由に通過します。しかし、細胞内のチオール基と反応した後、染色は細胞内に残り、娘細胞に受け継がれます。染色により、アッセイ内の可視化が大幅に容易になります。これらの一時的な染色は、蛍光がこれらの実験の時間枠である2〜3日間存在するため、これらのアッセイに理想的です。また、多くの異なる色の使用が可能になり、蛍光タンパク質トランスフェクト細胞株を作成する必要がなくなります。
   1. 各細胞の状態について、2 mLの無血清DMEMに2 μLの10 mMストック細胞染色液を混合して、10 μMの色素溶液を調製します。これを37°Cに温めてから細胞に加えます。
   2. 6 mLプレート内の培地を取り出し、接着性HNSCC細胞をプレート上に残します。2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加し、各プレートに添加した10 μM細胞染色/無血清DMEMを2 mL除去します。
   3. 細胞染色剤を付着させた6 mLの培養プレートを37°Cインキュベーターに40分間戻します。
   4. 40分後、培地を吸引します。PBSを2mL加え、吸引します。各プレートに0.025%トリプシン1 mLを加え、37°Cインキュベーターで交換します。
   5. 3〜5分後に2 mLのDMEMを10% FBSとともに加え、懸濁した細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を回転させ、10% FBSを含む1 mLのDMEMに再懸濁します。
   6. 血球計算盤または自動セルカウンターで細胞をカウントし、10% FBSを含むDMEMを添加して、1mLあたり300,000細胞の最終細胞濃度を作成します。

4. 頭頸部がん細胞のめっき

1. インキュベーターからマトリックスDRGアッセイを含むガラス底プレートを取り出します.
   手記：繰り返しになりますが、神経突起がマトリックスの端までの道のりの少なくとも75%にある場合、これは通常2〜3日後に発生します。これは、少なくとも 10X 対物レンズを使用して見るのが最適です。
2. ガラス底板内の媒体を吸引します。マトリックスDRGユニットを取り外すことなく、ガラスウェル内の培地を完全に吸引します。
3. 200 μLのピペットを使用して、300,000細胞/mLの培地のうち200 μLを吸い上げます。各マトリックスDRGアッセイに2滴の細胞を置きます。各マトリックス液滴に対してこの手順を実行し、1つのプレート上に各細胞条件を4回繰り返します
   手記： マトリックスの半球形状により、細胞はアッセイの周辺に沿ってリング状に沈殿することができます(図3a、図3b)。スムーズなトリガーを備えたピペットを見つけると、均一な滴の配置がはるかに簡単になります。
4. 4倍顕微鏡下で、類似の細胞数とさまざまな細胞条件の分布を確認します。
5. ガラス底板を37°Cのインキュベーターに約60分間
   手記：少量の細胞と培地(~150 μL)しかありませんが、インキュベーターの時間が数時間経過するまでアッセイは乾燥しません。
6. 60分後、ガラス底板の側壁に沿って4mLのDMEMを10%FBSで静かに加えます
   手記：一定期間にわたって、細胞はプレート底部に部分的に付着し、培地を添加する方法は細胞を乱さない。細胞の種類が異なれば、ガラス底板に付着し始めるのに多かれ少なかれ時間がかかる場合があります。
7. この時点で外因性の薬物や成長因子を交換して、以前の濃度レベルを維持します。
8. アッセイを37°Cインキュベーターに戻します(顕微鏡で検査する場合を除きます)。このアッセイの結果を顕微鏡イメージングで定量します。簡単に言うと、4 倍の顕微鏡画像を使用して、4 つの象限内の神経周囲浸潤のストランドを数えます。
   手記：4倍の対物レンズと蛍光機能を備えた顕微鏡は、アッセイを写真で記録するのに十分です。アッセイのサイズは、神経周囲浸潤の個々の領域を捉えるのに十分な詳細さを持つ4X対物レンズのフィールドにうまく収まります。神経周囲浸潤は24時間以内に明らかになりますが、48時間を超えると、腫瘍細胞がマトリックスの周辺に沿って分裂して浸潤するため、アッセイの完全性が弱まり始めます。48時間を超えると、DRGからの線維芽細胞のかなりの流出もあり、明視野顕微鏡による視覚化が不明瞭になります。したがって、この期間中に少なくとも2回(例えば、腫瘍細胞をプレーティングしてから24時間後と48時間後)に、4倍顕微鏡で結果を写真記録することをお勧めします。これらは3次元アッセイであり、アッセイ全体を完全にイメージングすることは困難であることに注意してください。ほとんどの神経周囲浸潤は、プレートの底部から平面内で発生し、細胞はプレートの底部の少し上のマトリックスに埋め込まれます。この平面は水平に近いため、腫瘍細胞を持つ神経突起の大部分は、4Xのシングルレベル画像に捉えられます。

結果

図 1.DRGマトリックスアッセイ。マトリックス液滴内の後根神経節の正しい配置(4Xの明視野顕微鏡で示)。スケールバーは1mmを表します。

図 2.神経突起の成長。神経突起は、DRGをマトリックス液滴(A)に配置した直後の0日目に存在しません。1日目(B)までに、神経突起の伸長は明視野顕微鏡で10倍で明らかになります。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F-12 50/50 L-グルタミンと 15 mM HEPES の混合	コーニングセルグロ	10-090-履歴書	バージニア州マナサス
ウシ胎児血清	アトランタの生物製剤	S11150	ジョージア州フラワリーブランチ
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	ライフテクノロジーズ株式会社	25200056	ニューヨーク州グランドアイランド
リン酸緩衝生理食塩水1x	コーニング	21-040センチ	バージニア州マナサス
マトリゲル hESC-クオリフマウス	コーニングインコーポレイティッド	354277	マサチューセッツ州ベッドフォード
ガンマ線照射35mmガラス底培養皿	MatTek株式会社	P35G-1.5-14-C	マサチューセッツ州アッシュランド
SteREO Discovery.V8 手術用顕微鏡	カールツァイスマイクロイメージング	495015-0021-000	ソーンウッド、ニューヨーク州
Schott ACE I光源	ショット	A20500(エー20500	ドイツ
セルトラッカー	ライフテクノロジーズ株式会社	C2925	カリフォルニア州カールスバッド
BDプレシジョングライドニードル 21G	BDの	305195	ニュージャージー州フランクリンレイク

) ス