がん側集団弁別アッセイ:Hoechst Dye Efflux Assayを用いたがん幹様細胞の単離法

要約

出典:Gilormini, M. et al.幹細胞特性を持つ頭頸部扁平上皮がん亜集団の単離と特性評価。 J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、蛍光活性化セルソーターまたはFACSを使用して、頭頸部扁平上皮癌細胞株から癌幹様細胞の亜集団を分離する方法について説明します。細胞の分離された側集団は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。

プロトコル

1. Hoechst Dye Efflux Assayによるサイドポピュレーション(SP)の選択

1. Hoechst 33342 色素による 5,000 万個の細胞の染色
   1. 底が円錐形の15 mL滅菌チューブを2本調製します:1本は「Hoechst」とラベル付けされ、もう1本は「Hoechstおよびベラパミル」とラベル付けされています。滅菌水に5 mMのベラパミル塩酸塩溶液10 mLを調製します。幹細胞用の培地(CM)を調製します。
      1. CSC(CM-CSC)のCMを準備するには、以下を組み合わせます:ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM):F12(1:3、v:v)、5%の子牛胎児血清(FCS)、0.04 mg / Lのヒドロコルチゾン、100 U / mLのペニシリン、0.1 g / Lのストレプトマイシン、および20 μg / Lの上皮成長因子(EGFR)。.
   2. 層流フードの下で、細胞をトリプシンします。培地を取り出し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、1 mLのトリプシン-EDTA(0.5 g/L)を加えて75 cm²のフラスコにします。37°Cで3分間インキュベートし、親細胞株に使用した培地を添加して反応を停止します。セルカウンターを使用してセルの数をカウントします。
      1. 親細胞株(CM-P)のCMを調製するには、DMEMに10%FCS、0.4 mg / Lのヒドロコルチゾン、100 U / mLのペニシリン、および0.1 g / Lのストレプトマイシンを補充します。.
   3. ステップ1.1.2で得られた細胞懸濁液を希釈して、CM-Pで10⁷細胞/mLを得ます。調製した2本のチューブで細胞懸濁液を分割します:チューブ「HoechstおよびVerapamil」に100μL(10⁶細胞)を入れ、チューブ「Hoechst」に4mL(4 x 10⁷細胞)を入れます。
   4. サンプル「Hoechst and Verapamil」に5mMのベラパミル塩酸塩溶液(最終濃度:0.5 mM)10 μLを加え、穏やかに混合します。1 g/L Hoechst溶液(最終濃度:0.1 g/L)を5 μL加えます。サンプル「Hoechst」に、¹⁰ 6細胞あたり5 μLの1 g/L Hoechst溶液(合計200 μL)を加えます。今後は、アルミホイルを使用してサンプルを直射日光から保護してください。
   5. すべてのチューブを37°Cのウォーターバスで1時間30分インキュベートし、細胞が沈降しないように15分ごとに穏やかに混合します。
   6. チューブを250 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、各ペレットを2 mLの1x PBSで再懸濁します。
   7. チューブを250 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。「Hoechst and Verapamil」ペレットをPBSバッファーで希釈した5 mg/Lヨウ化プロピジウム(PI)500 μLに再懸濁し、「Hoechst」ペレットをPBSバッファーで希釈した5 mg/L PIの4 mLに再懸濁します。
   8. 70 μmのセルストレーナーにサンプル溶液を移し、凝集体を除去し、チューブ内の単一細胞を回収して、フローサイトメーターでサンプルを取り込みます。サンプルを氷上に保管し、アルミホイルを使用して直接光にさらされないように保護します。

2. 細胞選別によるヘキスト色素を除くサイドポピュレーションの単離

1. UVレーザー(355 nm)、青色のHoechst(450/50 BP)フィルターと赤色のHoechst(610/20 BP)フィルターを備えたUVレーザー光路上の2つの検出器、および2つのコレクターを使用して、フローサイトメトリーソーターでHoechstネガティブセル分離を実行します。
   1. まず、染色およびフローサイトメーターのセットアップのポジティブコントロールとして機能するサンプル「Hoechst」を分析します。
   2. サイトメーターソフトウェアを使用して、「Global Worksheet」ウィンドウで「Dot Plot」(右上の5番目の写真)をクリックし、グローバルワークシートにチャートを作成します。縦軸では、右クリックでFSC-A(前方散乱)を選択し、横軸ではSSC-A(側面散乱)を選択します(図1A)。同様に、SSC-W と SCC-H のドット プロットを作成します。この 2 番目のドット プロットで P1 領域を作成するには、[Polygon gate](右上の 14 番目の図) をクリックします (図 1B).
      手記： P1領域は、単一細胞を包含し、ダブレットを判別します。
   3. オプション:P1でFSC-A対PIゲーティングを作成することにより、PI陽性細胞を除外します。このドットプロットで、PI陰性母集団(P2)を選択して、PI陽性の死細胞を除外します。
   4. サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバルワークシート」ウィンドウで「ドットプロット」をクリックし、グローバルワークシートにグラフを作成します。縦軸で、右クリックで、青いHoechst-Aを選択し、横筋で、赤いHoechst-Aを選択します。母集団を右クリックして、「母集団を表示」とP1を選択します。このドットプロットで、細胞のメイン集団の左側にサイドアームとして現れるネガティブなHoechst色素サイドポピュレーション(SP)細胞を選択する領域(P2)を作成します(図1C)。
2. サンプル「Hoechst」を分析し、10,000個のイベントを収集します。SP ポピュレーションを表すゲート P2 が適切な位置にあることを確認するには、サンプル "Hoechst and Verapamil" (10,000 イベント) を分析して、SP ポピュレーションの消失を観察します (図 1D)。
3. ステップ1.1.1で調製した1 mLのCM-CSCを含む15 mLチューブにSP Hoechst色素陰性細胞を回収します。
4. 細胞ソーティングの最後に、細胞懸濁液を250 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを1 mLのCM-CSCで再懸濁します。セルカウンターを使用して選別された細胞の数をカウントし、適切な数の細胞を培養フラスコに移します(表1を参照)。CM-CSCを添加し、37°Cおよび5%_CO2雰囲気でインキュベートします。
5. 細胞を同じ条件下で最大2継代し、最小5 x 10⁷個の細胞が得られるまで培養します。

表1:ソーティングされた細胞の数に応じて使用する培養フラスコのタイプ。ソーティングされた細胞のおおよその数に対する培養フラスコのサイズの詳細が示されています。トリプシンの量と培養フラスコタイプに必要な培地の量も提供されます。

個 個 名

ソートされたセルの数	培養フラスコタイプ	トリプシン量(mL)	培養液量(mL)
10,000-200,000	6ウェルプレートまたは3.5cmシャーレの1ウェル	0.5	2
200,000-1,000,000	T25培養フラスコ1	1	4
>100万円	T75培養フラスコ1	2	10

結果

図1:Hoechst色素を除いたサイドポピュレーションの単離。(A)FSC-AとSSC-Aのドットプロット。(B)SSC-W対SSC-Hドットプロット。(C、D)「Hoechst」管(C)または「Hoechst and Verapamil」管(D)を使用したHoechst Red-AとHoechst Blue-Aのドットプロット。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フェタルカーフセラムゴールド	GEヘルスケア	A15-151
ヒドロコルチゾン水溶性	シグマ・アルドリッチ	H0396-100MGシリーズ
ペニシリン/ストレプトマイシン100x	ドミニク・ダッチャー	L0022-100
DMEM	ギブコ	61965-026
F12 ナットミックス (1個) + GlutaMAX-I	ギブコ	31765-027
EGFの	プロメガ	G5021	溶液は調製する必要があります それは非常に であるため、使用直前 不安定
ヘパリン	StemcellTMテクノロジー	7980
B-27 サプリメント (50倍)、マイナス ビタミンA	ギブコ	12587-010
ペニシリン/ストレプトマイシン100x	ドミニク・ダッチャー	L0022-100
DMEM	ギブコ	61965-026
B-27 サプリメント (50倍)、マイナス ビタミンA	ギブコ	12587-010
ヘキスト33342	シグマ・アルドリッチ	14533	腐食性、急性毒性(経口、 皮膚、吸入)カテゴリー4
ベラパミル塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	V型4629	急性毒性(経口、経皮、 吸入)カテゴリー3
ヨウ化プロピジウム	シグマ・アルドリッチ	P4170	急性毒性(経口、経皮、 吸入)カテゴリー4
SQ20B細胞株	ジョン・リトルからの贈り物 研究室	-
FaDu細胞株	ATCCの	HTB-43
BD FACSDiva ソフトウェア v8.0.1	BDバイオサイエンス	-

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