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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 脊髄の採取
- CO2チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。頸椎脱臼は、せん断力により神経節根に損傷を与える可能性があるため、避けてください。ここからは、すべてのステップを無菌条件下で行ってください。
- 動物を70%エタノールに浸します。このステップは、滅菌や髪の毛が内臓を引きずるのを防ぐために重要です。
- マウスをエタノールから乾かしておきます。神経毒性によるエタノールと内臓の接触を防ぎます。
- マウスを乾燥させた後、ピンを使用して腹臥位(下向き)に配置します。各後肢と前肢にピンを配置します。
- 鉗子を使用して、後頸部から腰椎まで頭蓋尾側に伸びる正中線切開を行います。次に、鉗子を使って真皮フラップを両側に上げ、皮下組織を露出させます。
- 頭蓋頸部接合部に到達するまでマウスの頭蓋骨を触診します。動物に垂直なハサミを使用して、重い鉗子を使用して、頭蓋頸部接合部(7番目の頸椎)で頸部の筋肉と脊椎を切り取ります。脊椎を尾側に解剖し、重い鉗子で腰椎レベル(後肢レベル)に達するまで脊椎を切除します。
- 重い鉗子を使用して、腰椎レベル(5番目の腰椎)で完全な尾側離断を行います。
- マウスをロールオーバーします(表を上にします)。DRGは頸部ではなく下部の椎骨レベルから抽出されるため、切開部を覆う必要はありません。
- 首から腹部までの正中線を切開し、皮膚を横方向に引っ込めてから、腹膜を開くために切開します。
- 腹膜の内側の内臓(肝臓、脾臓、膵臓、胃、腸)をまとめて取り出します。次に、後腹膜器官(腎臓と膵臓)を切除します。頭蓋骨で、胸壁を開きます。
- 鉗子と外科用ブレードを使用して、肋骨を切断し、肋骨を脊柱から両側に離します。この時点で、脊柱は体の他の部分から分離されます。
- 冷たい(4°C)新鮮なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液から脊柱を2回洗います。