脊髄抽出:In vitro研究のためのマウス脊髄を分離するためのプロトコル

要約

出典:Na'ara, S. et al. 癌性神経浸潤のインビトロモデリング:背根神経節モデル。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、in vitro研究のためにマウスモデルから脊髄を分離するための段階的なプロトコルについて説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脊髄の採取

1. CO₂チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。頸椎脱臼は、せん断力により神経節根に損傷を与える可能性があるため、避けてください。ここからは、すべてのステップを無菌条件下で行ってください。
2. 動物を70%エタノールに浸します。このステップは、滅菌や髪の毛が内臓を引きずるのを防ぐために重要です。
3. マウスをエタノールから乾かしておきます。神経毒性によるエタノールと内臓の接触を防ぎます。
4. マウスを乾燥させた後、ピンを使用して腹臥位(下向き)に配置します。各後肢と前肢にピンを配置します。
5. 鉗子を使用して、後頸部から腰椎まで頭蓋尾側に伸びる正中線切開を行います。次に、鉗子を使って真皮フラップを両側に上げ、皮下組織を露出させます。
6. 頭蓋頸部接合部に到達するまでマウスの頭蓋骨を触診します。動物に垂直なハサミを使用して、重い鉗子を使用して、頭蓋頸部接合部(7^番目の頸椎)で頸部の筋肉と脊椎を切り取ります。脊椎を尾側に解剖し、重い鉗子で腰椎レベル(後肢レベル)に達するまで脊椎を切除します。
7. 重い鉗子を使用して、腰椎レベル(5^番目の腰椎)で完全な尾側離断を行います。
8. マウスをロールオーバーします(表を上にします)。DRGは頸部ではなく下部の椎骨レベルから抽出されるため、切開部を覆う必要はありません。
9. 首から腹部までの正中線を切開し、皮膚を横方向に引っ込めてから、腹膜を開くために切開します。
10. 腹膜の内側の内臓(肝臓、脾臓、膵臓、胃、腸)をまとめて取り出します。次に、後腹膜器官(腎臓と膵臓)を切除します。頭蓋骨で、胸壁を開きます。
11. 鉗子と外科用ブレードを使用して、肋骨を切断し、肋骨を脊柱から両側に離します。この時点で、脊柱は体の他の部分から分離されます。
12. 冷たい(4°C)新鮮なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液から脊柱を2回洗います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉗子	シグマ・アルドリッチ	F4142
外科用ブレード	シグマ・アルドリッチ	Z309036
鋏	シグマ・アルドリッチ	S3271
35 mmシャーレ、ガラス底	デ・グルート	〒60-627860
70%エタノール	シグマ
コールドPBS	バイオ産業	02-023-1A