メチルチアゾリルテトラゾリウムまたはMTTアッセイ:がん細胞の代謝活性の測定を通じて薬剤耐性を測定する比色アッセイ

要約

出典:Sciarrillo, R. et al. RNAシーケンシングを使用して、In vitroがんモデルにおける薬剤耐性に関連する新規スプライスバリアントを検出します。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、がん細胞の薬物誘発性細胞毒性を測定し、その代謝活性を決定するための比色アッセイ、メチルチアゾールテトラゾリウム(MTT)アッセイについて説明しています。このアッセイは、テトラゾリウム塩の細胞のミトコンドリア活性を反映した着色物への代謝変換に基づいています。

プロトコル

1. 白血病細胞のMTTアッセイ

1. MTT溶液を事前に準備します:500 mgのMTTホルマザンを10 mL PBSに溶解し、マグネチックスターラーで約1時間攪拌します(光から保護されています)0.22 μmフィルターで溶液を滅菌します
   手記：溶液は-20°Cで10mLアリコートに保存できます。解凍後は直射日光を避けてください。
2. 酸性化イソプロパノールを事前に準備する:2.5Lのイソプロパノールに50mLの2M HClを加えます
   手記：溶液を室温で少なくとも1ヶ月間保存してから使用してください。イソプロパノールが正しく酸性化されていないと、媒体と沈殿物を形成し、分光光度法の読み出しが損なわれる可能性があります。
3. 成長阻害のより正確な推定を確実にするために、別の96ウェル平底「Day 0」(コントロール)プレートを準備します:細胞株ごとに3〜6ウェルを専用にし、各ウェルごとに30μLの成長培地と120μLの細胞懸濁液(8,000細胞)と150μLの成長培地をブランク(細胞なし)に対応するウェルに追加します。このセクションのステップ 1.9 からステップ 1.13 に進み、光学濃度 (OD) を測定します。
4. 96ウェル平底実験プレートを調製する:30ウェルを薬物濃度専用(10濃度、各3倍)、10ウェルを細胞制御用、10ウェルを細胞なし(ブランク)の制御用培地に充て、ジメチルスルホキシドを溶媒として使用してデキサメタゾン(Dex)の薬物希釈範囲を調製します
   手記：CEM-WT細胞の場合、Dex希釈範囲は2μM〜0.97nMです。CEM/R30dm、CEM-R5、CEM-C3細胞の場合、Dex希釈範囲は640 μMから0.33 nMです。
5. 各Dex希釈液から30 μLを96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。各濃度を三重に含めてください。
6. コントロール細胞に対応するウェルに30μLの増殖培地を、ブランクに対応するウェルに150μLの増殖培地を添加します。
7. 指数関数的に増殖する細胞を収穫し、最適な播種濃度で再懸濁します.
   手記：最適な開始細胞濃度を決定するためには、96ウェルプレートで細胞を数濃度で播種し、少なくとも4日間毎日測定することにより、各細胞株の増殖プロファイルを評価することが推奨されます。72時間後の細胞の過成長を防ぐ播種濃度を選択すると、OD値が飽和して実験に影響を与えます。CEM-WT、CEM-C5、CEM-R5では、最適な播種濃度は8,000細胞/ウェル、CEM/R30dmでは5,000細胞/ウェルです。
8. 120 μLの細胞懸濁液を、薬物溶液または増殖培地(コントロール細胞に対応するウェル)を含む各ウェルに加えます。プレートの外側の空のウェルに150 μL PBSを充填してプレート内の湿度を良好にし、細胞培養インキュベーターでプレートを5% CO₂で37°Cで72時間インキュベー
トします。
9. 各ウェルに15 μLのMTT溶液を加え、プレートシェーカーで最大900振/分までプレートを5分間振とうします。
10. プレートを5%CO₂を含む37°Cに戻し、細胞培養インキュベーターに置き、さらに4〜6時間インキュベー
トします。
11. 酸性化したイソプロパノール150μLを各ウェルに加え、マルチチャンネルピペットでよく混合して、すべてのホルマザン結晶を完全に再懸濁します。ブランクウェルから始めて、プレートの別の列に進む前に、チップをよくすすいでください。
12. プレートを室温(RT)で10分間インキュベートします。
13. マイクロプレートリーダーを使用して、540 nmと720 nmのODを決定し、バックグラウンドODを補正して正確な測定を確保します。次に、データをスプレッドシートファイルに保存して分析します。

2. MTTアッセイのデータ解析

1. 次の式を使用して、「0日目」のセルのOD値を計算します:
   OD_0日目 = OD_{コントロールセル} - 平均 OD_{ブランクウェル}
2. 次の式に従って、各薬物濃度の生存細胞の割合を計算します:
   処理細胞数 = 平均 [OD_処理細胞 - 平均 OD_{ブランクウェル} - OD_{Day 0}]/[OD_対照細胞 - 平均 OD_{ブランクウェル} - OD_Day0]*100
3. 用量反応曲線(薬物濃度と成長阻害(%))をプロットします。
4. 用量反応曲線を使用して、細胞の増殖を50%阻害する薬物の濃度(IC50)を計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CCRF-CEMの	ATCC, マナッサス, バージニア州, USA	ATCC CCL-119
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA (米国カリフォルニア州カールスバッド)	11875093
ウシ胎児とウシの血清	Greiner Bio-One、フリッケンハウゼン、ドイツ	758093
ペニシリンGストレプトマイシン硫酸塩	Gibco, Carlsbad, CA, USA (米国カリフォルニア州カールスバッド)	15140122
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン	シグマ・アルドリッチ	252859
CELLSTAR細胞培養フラスコ 25角	Greiner Bio-One、フリッケンハウゼン、ドイツ	82051-074
MTTフォルマザン	シグマ・アルドリッチ	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec、Heerhugowaard、オランダ		UV-Vis96ウェルプレート分光光度計
Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート	テス・グライナー/シグマ	M0812-100EA
リン酸緩衝生理食塩水(NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG、ドイツ	362 3140
トリプシン/EDTA溶液100ml	ロンツァ、バーゼル、スイス	CC-5012

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